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1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询脱氢表雄酮对内皮细胞 NO, ET作者：周娟，杨予白，奥沛源，雷立权 【关键词】 内皮缩血管肽 【Abstract】 AIM: To investigate the influence of dehydroepiandrosterone on the synthesis of NO, secretion of ET1 and the expression of ICAM1 in endothelial cells. METHODS: The cultured human umbilical vein endothelial cells ECV
2、304 was treated by DHEA and the level of NO and ET1 in medium was detected by nitrite/nitrate colorimetric method and radioimmunoassay. The surface expression of ICAM1 on cells was detected immunohistochemically. RESULTS: In comparison with those of control, the content of NO in medium decreased fro
3、m (38712) to (24211) mol/L (P 0.05), but the concentration of ET1 in medium increased from (39713) to (62629) ng/L (P 0.05) along with the increase of concentration of DHEA. The content of NO in medium of control group was similar at every time point（P 0.05）, but DHEA timedependently decreased the c
4、ontent of NO (P 0.05). The concentration of ET1 in medium 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询timedependently increased both in control group and in DHEA group (P 0.05), and it was higher in DHEA group. Higher concentration of DHEA or longer treatment time, DHEA did not affect the ICAM1 expression. CONCLUSION
5、: DHEA can adjust the function of vessels by regulating the production of NO and ET1 of endothelial cells. 【Keywords】 dehydroepiandrosterone; ECV304 cells; nitric oxide; endothelin1; intercellular adhesion molecule1 【摘要】 目的： 观察脱氢表雄酮对内皮细胞 NO 合成、ET1 分泌及细胞表面 ICAM1 表达的影响. 方法： 培养的人脐静脉内皮细胞系 ECV304 经不同浓度和不
6、同作用时间 DHEA 处理后，采用硝酸还原酶及放免法分别测定培养液中 NO 及 ET1 水平,用 SABC 免疫组化法观察细胞表面 ICAM1 的表达. 结果： 与对照组相比, 随着 DHEA 浓度的增加，培养液中 NO 的含量从(38712)降至(24211) mol/L (P 0.05), 而 ET1 的浓度却从(39713)增至(62629) ng/L (P 0.05). 随着时间的延长，各对照组培养液中 NO 含量均无明显变化（P 0.05） ，而 DHEA 组 NO 生成量却逐渐降低(P 0.05)，呈时间依赖. 培养液中 ET1 浓度无论是对照组还是 DHEA 组均随时间的延长而升
7、高(P 0.05） ，但 DHEA 组升高的更为明显. 无论是增加浓度还是延长时间, DHEA 均不影响细胞表面 ICAM1 的表达. 结论： DHEA 可通过调节内皮细胞 NO 及 ET1 生成量对血管功能进行调控. 【关键词】 脱氢表雄酮；ECV304 细胞；一氧化氮；内皮缩血管精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询肽 1；胞间粘附分子 1 0 引言 血管内皮细胞的损伤及功能改变在动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的发生中意义重大. 脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone, DHEA）是性激素合成过程的中间产物，主要由肾上腺皮质网状带分泌
8、，是血浆中浓度最高的类固醇激素. 研究表明，DHEA 可能是人体的一种内源性抗 AS 因子1,2 ，因而具有治疗及预防 AS 的应用前景. 但目前对其作用机制知之甚少. 我们采用培养的人脐静脉内皮细胞系 ECV304，观察脱氢表雄酮对其一氧化氮（NO） 、内皮素 1（ET1）生成水平及细胞表面细胞间黏附分子 1（ICAM1）表达的影响，以期从内皮细胞的角度说明 DHEA 的抗AS 作用，并为从性激素稳态角度探讨男性内源性抗 AS 机制提供依据. 1 材料和方法 1.1 材料 ECV304 人脐静脉内皮细胞系购自中科院协和基础研究所；RPMI1640 培养基购自 Gibco 公司，胰蛋白酶及 D
9、HEA 均来自 Sigma公司；NO 含量试剂盒购自南京建成生物工程研究所,ET1 含量试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免所，SABC 免疫酶标试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，其他相关试剂均为国产分析纯. 1.2 方法 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询1.2.1 细胞培养细胞经 2 g/L 胰蛋白酶与 0.2 g/LEDTA 的消化液消化后，用含 100 mL/L 新生小牛血清的 RPMI1640 培养液制成细胞悬液，接种在培养瓶内，置于 50 mL/L CO2 的培养箱中 37培养，每 23 d 更换培养液，生长融合的细胞，经消化后进行传代培养. 1.2.2NO
10、 及 ET1 水平的测定生长良好的内皮细胞经消化后，以5107 个/L 接种于放有盖玻片的 12 孔培养板，待细胞贴壁，弃去旧培养液，用无血清培养液冲洗 2 遍，加入各种实验用液, 继续培养相应时间后，收集上清，采用硝酸还原酶法测 NO 含量，放免法测ET1 含量. 1.2.3 细胞表面 ICAM1 的表达收集完上清，取出附着有细胞的盖玻片，PBS 冲洗 3 次，40 g/L 多聚甲醛固定，按 SABC 免疫酶标法进行. 细胞中呈现棕褐色或棕黑色颗粒者为阳性细胞，每张切片选取 5 个视野，计算 200 个细胞中的阳性细胞数,取其均值. 1.2.4 实验分组 1.2.4.1 不同浓度 DHEA
11、对内皮细胞功能的影响对照组为无血清培养基组, 实验组为含终浓度分别为 1， 10， 100， 1000 nmol/L DHEA 的无血清培养基组，作用时间为 24 h. 1.2.4.2 不同作用时间 DHEA 对内皮细胞功能的影响对照组为无血清培养基组, 实验组为加入终浓度 10 nmol/L 的 DHEA，作用时间分别为 12， 24 和 36 h. 统计学处理： 数据以 xs 表示，SPSS11.0 统计软件分析，不精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询同浓度 DHEA 对内皮细胞功能影响的结果采用单因素方差分析；不同作用时间 DHEA 对内皮细胞功能影响的结果采用重复测量方
12、差分析，P 0.05 为有统计学意义. 上一页 1 2 下一页2 结果 2.1 不同浓度 DHEA 对内皮细胞功能的影响与对照组相比，DHEA可明显抑制细胞 NO 的合成，同时促进 ET1 的分泌(P 0.05)，并呈浓度依赖. 但各种浓度的 DHEA 对细胞表面 ICAM1 的表达均无影响(Tab 1).表 1 不同浓度的 DHEA 对内皮细胞功能的影响（）略 2.2 不同作用时间 DHEA 对内皮细胞功能的影响随着时间的延长，各对照组培养液中 NO 含量均无明显变化，而 DHEA 组 NO 生成量却逐渐降低 (P 0.05), 呈时间依赖. 培养液中 ET1 浓度无论是对照组还是 DHEA
13、 组均随时间的延长而升高(P 0.05） ，但 DHEA 组升高的更为明显. 各时段 DHEA 组与对照组细胞表面 ICAM1 的表达均较低，且无统计学意义(Tab 2).表 2 不同作用时间的 DHEA 对内皮细胞功能的影响（略） 3 讨论 本实验结果表明，ET1 的基础分泌量在 12 h 内较低，24 及 36 h后浓度逐渐增加，且 DHEA 组升高的更明显. 对照组培养液中 NO 含量不随时间的延长而变化，但 DHEA 组 NO 生成量却逐渐降低, 并呈时间依赖. 阮骊韬等3的研究结果也提示 ET1 的产生是一种累积精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询过程. 由于体外实验
14、没有清除 ET1 的场所，随着不断的分泌，培养液中 ET1 的浓度也将不断升高. 由于 NO 合成的减少可增加 ET1 的分泌. 因此，本实验中 DHEA 组的 ET1 较对照组高，很可能是由于DHEA 一方面直接促进 ET1 的分泌；另一方面也可通过减少 NO 的合成，从而使 NO 抑制 ET1 分泌的作用减弱，最终导致培养液中 ET1 的含量逐渐增加. 但 DHEA 为何会抑制细胞 NO 的生成，本实验未作进一步探讨. ET1 主要由内皮细胞合成、释放，并以旁分泌的形式作用于附近的平滑肌细胞，引起平滑肌细胞的收缩和增殖. 而 NO 则可导致平滑肌的扩张及增殖受抑. 目前，关于 ET1 与
15、NO 间的相互关系及其在疾病发生中作用的具体机制仍不明确，推测二者之间可能存在反馈性调节. 在生理情况下，内皮细胞释放的舒张因子占优势，抑制血管的收缩和血小板的激活. 在病理情况下，ET1 和 NO 释放失衡，收缩因子占优势. 但过多的 NO 生成又可因局部自由基的产生而造成组织损伤4. 由于内皮细胞上 ICAM1 表达的增多具有明显的促 AS 作用，而本实验结果表明 DHEA 不影响细胞 ICAM1 的表达. 因此，本实验结果似可解释为： DHEA 通过对 ET1 分泌及 NO 合成的调节而间接影响血管平滑肌细胞的代谢及增殖，并与其他调节因子一起对生理条件下的血管功能进行调控. 对 DHEA
16、 作用受体机制的研究还表明,由于 DHEA 在体内是性激素精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询的前体物质，它可能转化为睾酮和雌激素而发挥其生物学效应5 ；DHEA 的作用也可能通过直接与细胞上特异性位点相结合而引发，与其在外周组织的代谢、转化无关6. 我们的实验证实（资料未列出）DHEA 也不大可能通过雌激素受体通路发挥其生物学效应. 【参考文献】 1 Bernini GP, SgroM, Moretti A, et al. Endogenous androgens and carotid intimalmedial thickness in women J. J Clin Endocrinol Metab, 1999; 84(6): 2008-2012. 2 Okamoto K. Distribution of dehydroepiandrosterone sulfate and relationships between its level and
