《脑还丹对Aβ诱导的海马神经元损害的抑制作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《脑还丹对Aβ诱导的海马神经元损害的抑制作用（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询脑还丹对 A 诱导的海马神经元损害的抑制作用【关键词】 中药复方脑还丹 摘要：【目的】探讨中药复方脑还丹对 A 诱导的海马神经元损害的保护作用。 【方法】采用 MTT 法及 NSE 免疫组化方法观察脑还丹含药血清对经 A25-35 处理的原代培养的新生大鼠海马神经元的影响。 【结果】体外培养的新生大鼠海马神经元经 A25-35 处理后，活细胞数减少，而脑还丹含药血清能够促进神经元的存活率以及促进神经元的生长发育，与对照组比较有显著性差异(005)。 【结论】脑还丹能够减轻 A 对海马神经元的毒性作用。 关键词：阿尔茨海默病/中药疗法；淀粉挥
2、蛋白；神经元/药物作用，细胞，培养的 老年性痴呆，即阿尔彩默病(Alzheimer s Disease AD)，是引起痴呆最常见的进行性退行性神经病。临床表现以认知功能减退为主，病理学特征包括神经元丢失、神经元纤维缠结(NFT)、老年斑(SP)和淀粉样血管病变等。-淀粉样蛋白(A)是 AD 病人老年斑中的主要成分，许多研究表明 A 与 AD 发病有关 。因此，保护神经元免受 A 的神经毒性可能是防治 AD 的有效手段之一。笔者在具有抗老防衰作用的古方“草还丹”的基础上总结了自己长期的临床实践经验，以骨碎补、熟地、菖蒲等组方“脑还丹” ，该方具有补肾填精、活血通络、涤痰开窍、平衡阴阳的功效，初步
3、研究表明， “脑还丹”对老年性痴呆患者及痴呆动物具有一定的疗效 。我们通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、神经元特异性稀醇化酶(NSE)精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询免疫组织化学方法以了解脑还丹对 A 诱导神经元损害的保护作用，为脑还丹防治老年性痴呆进一步提供实验依据。 1 材料与方法 11 试剂 DMEM/F12 培养基、小牛血清均由 Gibco 公司提供；A2535、多聚赖氨酸、MTT 均由 Sigma 公司提供；NSE 免疫组化试剂盒、NSE抗均由博士德公司提供；二甲基甲矾(DMSO)Dhanks，胰蛋白酶，磷酸缓冲液(PBS)，40g/L 多聚甲醛等。 12 仪器
4、 倒置显微镜、超净工作台(江苏苏净 BHC-1300A/B3 型)；二氧化碳培养箱(德国 Heraeus P63450 Hanau 型)；培养板(美国 Orange公司)；酶联免疫分析仪(Wellscan MK3 型)；全自动图像处理系统(德国 KONTRON IBAS20 型)。 13 动物 新生 SD 大鼠(24h 内)，SD 大鼠，由中山大学北校区实验动物中心提供。 14 脑还丹大鼠含药血清的制备 脑还丹由中药骨碎补 15g，熟地 25g，菖蒲 10g 等组成，使用颗粒剂(江苏江阴制药厂提供，批号 0208136)，按所含生药量配制成不同浓度的药液。取健康 SD 大鼠 30 只，2202
5、50g，雄性，随机分为 3 组，分别按 10g kg d、5g kg d剂量的药液把 1mL kg d生理盐水连续 7d，末次灌药后 1h 腹主动脉取血，离心精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询制备血清，分别标记为高剂量组，低剂量组及对照组，经过滤除菌后 4贮存备用。 15 淀粉样蛋白的“老化”处理 将 A 2535 1mg 溶解在 1mL DMEM/F12 培养基内，置于 37恒温箱内孵育 47d，进行老化处理，然后 4贮存备用，用时稀释。16 神经细胞培养 取新生 SD 大鼠脑，在解剖镜下分离出海马，用 DHanks 洗涤，125g/L 胰蛋白酶消化 3715min，过 2
6、00 目筛网，用含体积分数为15%小牛血清的 DMEM/F12 培养液终止消化并洗涤，制成单细胞悬液，计数。 17 MTT 比色法分析 将细胞悬液加入到预先经过多聚赖氨酸处理的 96 孔板培养孔中，每孔加入 0510个细胞(cells)，置 37、5%(体积分数，下同)CO培养箱内培养 24h，吸出培养液，随机分成高剂量组、低剂量组和对照组，每组 12 孔，分别加入含体积分数为 10%高剂量组、低剂量组和对照组血清的 DMEM/F12 培养基 150L 和稀释的老化 A 2535(终浓度为 5moL/L)，置 37、5% CO培养箱内培养72h。终止培养前 4h，每孔加入 20L MTT(5g
7、/L)继续培养，吸出培养基，每孔加入 150L DMSO，摇晃使 MTT 反应的蓝色产物充分溶解，将培养板放在酶联免疫分析仪上，采用实验波长为 595nm 和参考波为 630nm 测每孔样品的光密度()值。各组每次 812 孔，重精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询复 3 次。 18 NSE 免疫组织化学方法分析 将细胞悬液(细胞密度为 1/cm，即每 cm盖玻片含1个细胞)接种于 24 孔板内预先经多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，4h 后加入含体积分数为 15%小牛血清的 DMEM/F12 培养液，置37、5% CO培养箱内培养 24h，吸出培养液，随机分成高剂量、低剂量和对照组
8、 3 组，每组 3 孔，各组分别加入含体积分数 20%高剂量组、低剂量组和对照组血清的 DMEM/F12 培养基 1mL 稀释的老化A 2535(终浓度为 5mol/L)，置 37、5% CO培养箱内培养48h。弃去培养基，PBS 洗 3 次，40g/L 多聚甲醛室温固定15min。NSE 免疫组化按 SABC 免疫组化试剂盒说明书进行，各组每次 35 孔，重复 3 次。 19 图像分析 半经过 NSE 免疫组化染色后的盖玻片输入全自动图像处理系统，每张片随机选择 3 个视野，计数阳性细胞数，测定视野内全部神经细胞的胞体面积(A)最大长径(le,max)、最大短径(lsh,max)和平均突起长
9、度。 20 统计学分析 结果采用 SPSS110 for windows 统计软件进行分析。 2 结果 倒置显微镜下，刚分离接种的神经元呈圆形：4h 后已经贴壁并精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询开始形成短小突触；24h 后神经元形态呈圆形，椭圆型，锥形或多角形，13 个突起；加入 A 后部分神经元死亡。 21 MTT 比色法结果 不同剂量脑还丹含药血清组的光密度值见表 1。显示：高剂量组及低剂量组的光密度值升高，与对照组比较有显著性差异(001)；高剂量组与低剂量组之间无显著性差异。表 1 脑还丹含药血清对A 诱导的海马神经元细胞 MTT 法光密度值的影响（略） 22 NS
10、E 免疫组化结果 不同剂量脑还丹含药血清培养海马神经元 NSE 阳性细胞数及神经元胞体面积、最大长径、最大短径和平均突起长度见图及表 2。结果显示：高剂量组及低剂量组 NSE 阳性细胞数、胞体面积、最大长径、最大短径、平均突起长度均高于对照组，差异均有显著性(005)，高剂量组与低剂量组之间无显著性差异。表 2 脑还丹含药血清培养的 NSE 阳性细胞数、数量和形状比较（略） 上一页1 2 下一页3 讨论 AD 是导致痴呆的最常见的进行性神经变性疾病，在老年人中随着年龄的增加其发病率升高。A 是 AD 病人老年斑中的主要成分，由 39-43 个氨基酸组成，可溶型无神经毒性，当转变为不溶型时可损害
11、脑内与智力有关的特定结构。许多研究表明 A 与 AD 发病有关。淀粉样蛋白前体基因(APP)突变在早发家族性 AD 病人中已经被检测精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询到 。APP 转基因鼠的研究也是 A 在 AD 病因中作用的一个有力的证据，APP 过度表达致基因突变的转基因鼠出现与 AD 病人类似的神经病理改变及行为异常， ；转 APP 基因鼠用 A 免疫治疗可以减轻 AD 样病理改变更加证实 A 在 AD 中的作用 。近年来培养的神经细胞已经被用于 AD 中 A 诱导神经变性的模型中，由于海马结构与学习记忆功能密切相关，是 AD 病理损害集中的部位之一，故海马神经元原代培
12、养应用较多。研究表明 A 对体外培养的神经元具有毒性作用，且已经有实验证实 A 2535 与 A 1-40所致的神经变性的机制相似 。脑还丹是在抗老防衰的古方草还丹的基础上以骨碎补、熟地等组成，该方具有补肾填精、活血通络、涤痰开窍、平衡阴阳的功效。初步研究表明脑还丹能够改善老年性痴呆患者的临床症状 ；能够提高老齿大鼠血清雌二醇、睾酮水平，降低血粘度，能够提高去势老龄大鼠血清胰岛素样长生因子水平 ；维持去势老龄大鼠海马 CA3 区神经元结构和突触密度 。本研究在原代培养的海马神经细胞培养液中加入具有神经毒性的老化处理的 A 2535 的同时，加入一定浓度的脑还丹含药血清，通过 MTT 比色法、N
13、SE 免疫组织化学方法研究脑还丹的作用，结果表明在原代培养的海马神经细胞培养液中加入 A 2535 可导致细胞死亡，而脑还丹含药血清能够抑制 A 2535 导致的细胞死亡表现为细胞的存活率增加细胞面积增大及突触长度增长，证明脑还丹对 A 所致的神经元的损害具有保护作用。鉴于 A 与 AD 发病密切相关，故认为这可能是脑还丹治疗老年性痴呆的基础之一。但精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询是 A 的神经毒性的机理目前仍不清，有研究表明可能与 Ca稳态的破坏 、Na酶活性的降低 、神经元凋亡以及氧化还原障碍 、tau 蛋白磷酸化等有关。脑还丹通过哪一途径起作用有待进一步研究。 参考文
14、献： Goate A,ChartierHarlin M C.Mulan M,et al.Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimers disease Nature 1991,349:704. Moran P M,Higgins L S,Cordell B,et al.Agerelated learning deficits in transgenic mice expressing the 751amino acid isoform of hum
15、an betaamyloid precursor protein Proc Natl Acad Sci USA 1995,92:5341. Moechars D,Lorent K,De Strooper B,et al.Expression in brain of amyloid precursor protein mutated in the alphasecretase site causes disturbed behavior,neuronal degeneration and premature death in transgenic mice EMBO J,1996,15:1265. Schenk D,Barbour R,Dunn W,et al.Immunization with amyloid beta attenuates Alzheimerdiseaselike pathology in the PDAPP mouse Nature 1999,400:173. 李庆明，黄启辉脑还丹制剂治疗老年痴呆的临床研究精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询 老年医学杂志，2002，16(6)：169 程志安，李庆明脑还丹“对老齿去势大鼠”血清 IGF和血脂水平的影响 中国实验方剂学杂志，2
