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1、核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用输血相关传染病的预防和控制已经成为全社会关注的焦点,新技术的引进是进一步提高血液安全性的重要一环。本文就病原体核酸检测技术(nucleic acid testing, NAT)及其在国内外血液筛检中的应用情况和结果作一介绍,并对该方法在我国推广和应用的必要性和可行性作初步探讨。1.NAT 在血液筛检中的必要性酶免检测(EIA)技术已经广泛运用于血液筛检,该方法的灵敏度和特异性也在不断地改进和提高,但每年仍有少数新发输血后肝炎病例报道,如美国无偿献血者每单位供血传播 HBV、HCV 和 HIV 的危险性分别为 166000、1103000和 1676000
2、 1。这些危险的主要原因是: 病毒感染者“窗口期”献血,病毒变异,免疫静默感染(immuno silent infection)以及人工操作错误 2。所谓“窗口期”,是指从感染病原开始,直至用某种检测方法能够检测到该病原存在为止的这一段时间 3。血清学抗原、抗体检测的“窗口期”较长, 如 HBsAg、抗-HIV、抗-HCV 检测的“窗口期”分别为 45-56、22、72 4,5,故美国 90%以上输血传播 HIV 和 HBV 以及 75%以上输血传播 HCV 的危险性来自“窗口期”感染献血 6。EIA“窗口期”漏检是当前影响血液安全性进一步提高的瓶颈,对于献血者的筛选,单纯抗原或抗体血清学检测
3、不能有效地保障血液安全。 NAT 检测是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称。其基本步骤包括核酸提取、扩增、和检测。NAT 敏感性高,可检出标本中极微量的核酸 ,在病毒感染后数天即能检出,可大大缩短“窗口期” 。初步研究表明 ,混合血样 NAT 检测可将 HBV、HCV 和 HIV 感染的平均“窗口期”缩短 9d(缩短 “窗口期”20%)、59d(82%)和 11d(50%)5,7;此外 NAT 还可以检出因上述其它 3 种原因而漏检的被感染献血。如法国应用 NAT,从大约 150 万份献血中筛检出 4 份 HCV RNA 阳性、抗体阴性的样本,其中 1 份即为免疫静默感染 8。尽管 NAT
4、从理论上并不能完全消除感染“窗口期”,但病毒核酸转阳之前的血液传染性极低 ,可以有效地预防经输血传播病毒性疾病 9。因此,NAT 的引入可使输血传播疾病的危险性降到最低 10。2.NAT 检测的技术方法1985 年具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的发明,标志着 NAT 的诞生。随后,在 PCR 的基础上 ,派生出许多其它原理的体外 NAT 方法 11。这些技术灵敏度和特异性或高或低,操作或简单或复杂,适合在各自不同的领域运用，目前适用于大样本量血液筛查并能满足高灵敏度要求的扩证扩增技术主要为 PCR 技术和 TMA 技术。2.1PCR
5、 扩增方法PCR 是一种体外模拟自然 DNA 复制过程的核酸扩增技术,以其高敏感性、高特异性和快速简便等优势得到了广泛的应用。通过简单的技术改进和联合,涌现出了各种各样不同的 PCR 方法,如检测 RNA 的逆转录 PCR(RT PCR)、敏感性和特异性均较高的巢式 PCR (nested PCR)、可对靶序列进行定量检测的定量 PCR、检测基因超长分布的多重 PCR 以及 PCR 结合酶标技术(PCR ELISA)、PCR 结合寡核酸探针杂交技术(PCR SSOP)、荧光 PCR 和免疫 PCR 等。目前在临床检测中使用较多的是荧光定量 PCR,主要用于各种传染病的诊断、病毒滴度监测以及疗效
6、评估,因采用荧光标记的探针杂交或直接使用能和双链DNA 结合的荧光素检测 PCR 扩增产物,进一步提高了检测的敏感性和特异性。若加入已知浓度的内标或外标,便能进行定量检测。由于该方法实现了反应体系的全封闭和操作的全自动,不仅减少了污染,还提高了效率。虽然国内许多生物技术企业已经利用荧光 PCR 方法开发出成熟的 NAT 定量检测产品,如深圳匹基、广州达安、上海复星、上海科华、上海浩源等,但这些产品均只获得我国食品和药品监督部门的临床诊断使用许可证。而临床诊断和血液筛检是 2 个不同的应用领域, 血液筛检对试剂的要求要比临床诊断高很多。迄今为止正式通过美国 FDA 认证可用于血液筛检的试剂仅有
7、2 种,即 Roche COBAS Ampli Screen HBV/HCV/HIV 和 HIV 1/HCV 检测系统 ,FDA 评判这些试剂是否能用于血液筛检的标准之一: 必须对 50copies/ml 的病毒核酸的检出率95%。相当一部分国产荧光定量 PCR 检测试剂或许能在某些标本上获得 20copies/ml的灵敏度,但一般都很难满足 95%检出低病毒载量标本的要求。相信不断提高检测灵敏度,早日研发并注册成功我国自己的 NAT 血液筛检用试剂也是国内生物技术企业的发展目标。2.2转录介导的扩增方法包括转录介导的扩增系统(transcription mediated amplificat
8、ion,TMA)和核酸序列依赖扩增系统(nucleic acidsequence based amplification,NASBA)。TMA 是一种利用 Money 鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶和 T7 RNA 多聚酶 2 种酶的共同作用,在等温条件下来扩增 RNA 或 DNA 的反应系统,主要扩增原理为: 目标序列在逆转录酶作用下,以引物为引导进行逆转录, 逆转录酶的 RNA酶 H 活性将杂合链上的 RNA 降解以后,合成双链的 DNA,并在 T7 RNA 多聚酶作用下,转录出成千上万个目标 RNA 序列,这些 RNA 又可以作为模板进行下一个循环,整个反应是一个自催化过程。NASBA
9、 的原理与 TMA 相似,只是在核酸提取和扩增产物检测的方法上有所不同。这两种方法的特异性强,灵敏度高,反应条件简单,扩增效率高,无需专门的扩增仪器,且因整个反应在 1 个试管中进行,也减少了污染。2.3 其它 NAT 技术包括支链 DNA 检测技术(branched DNA signal amplification assay,bDNA)、环介导的等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification,LAMP)、连接酶链技术(ligase chain reaction, LCR)和链置换扩增(strand displacement amplificati
10、on,SDA)等。这些技术或因为自身原因,或因为刚研发出来尚未进入临床,均未在血液筛检中应用。如 bDNA 技术，在 1995 年左右推出,其信号放大是通过碱性磷酸酶(AP)标记的探针杂交结合到一个树枝状核酸枝状体上而实现的。bDNA 技术对待测 DNA 无扩增,特异性较好,能进行病毒定量检测,动态地揭示病毒滴度水平的变化,不仅在预测干扰素疗效方面可为临床提供更为有用的信息,还可作为丙肝病人对干扰素完全应答的标志反应。但也正因为bDNA 技术没有扩增待测核酸,其检测灵敏度远远低于 PCR,故该项技术实际上不适合用于血液筛检,目前国内主要将 bDNA 技术用于 HBV 或 HCV 病毒滴度的定量
11、分析。3.NAT 在国内外血液筛检中的应用3.1 开展 NAT 检测的国家及所用的技术NAT 是一种新兴的检测方法,许多国家及输血机构都进行了一系列的研究,在国外特别是一些发达国家和地区已普遍应用于血液筛检 12，例如,日本是世界上最早在全国范围内对血液进行 HBV、HCV、HIV NAT 筛检的国家 13,新加坡、中国香港也已经分别采用不同的方式对血液进行 NAT 筛检; 德国和荷兰从 1997年起就开始 NAT 筛检的尝试,英国和法国的部分血站也从 2000 年起开始了 NAT血液筛检; 美国则从 1999 年 3 月开始在 FDA 新药审核程序下使用不同的试剂进行常规血液筛检。开展 NA
12、T 检测的国家及其所采用的技术见表 1：表 1.开展 NAT 检测的国家及所用技术汇总国家或地区 技术 混合检测单检 Germany 德国(1997 年起部分,1999 年月起，全部） Netherlands 荷兰(1997 年起） U.K. 英国(2000 年起） Switzerland 瑞士 Japan 日本(1997 年月起对原料浆；1999 年初起献血者） Canada 加拿大 USA 美国(1999 年 3 月起） New Zealand 新西兰 Australia 澳大利亚 Singapore 新加坡 Portugal 葡萄牙 France 法国(2000 年起） Spain 西班
13、牙 Italy 意大利 Hong Kong 香港 台湾（2005 年准备中） 韩国（2005 年 1 月起） PCR PCR PCR PCR PCR PCR TMA/PCR TMA TMA TMA TMA TMA / PCR TMA / PCR TMA / PCR TMA TMA / PCR Pool Pool Pool Pool Pool pool pool/IDT IDT pool / IDT IDT IDT Pool / IDT Pool Pool pool Pool Pool TMA/PCR各国采用的技术各不相同（参见表 1） 。日本使用的方法为罗氏公司与日本红十字会共同开发的全自动的
14、 Ampli NAT NPX 系统（为荧光 PCR 技术，可同时联合检测 HBV,HCV 和 HIV） ，目前正在考虑使用 Chiron 公司的 TMA 技术;美国 ARC 和新加坡使用的是 Chiron 公司的 TMA 技术;美国血液中心(ABC)系统则使用罗氏 COBAS Ampli Screen; 荷兰及部分欧洲国家将荷兰阿克苏公司推出的Nucliesens 全自动核酸提取方法同罗氏的 COBAS Ampli Screen 扩增体系结合起来使用;而英国和法国的部分血站在 2000 年采用的是 Qiagen 的全自动核酸提取系统与罗氏的 COBAS Ampli Screen 扩增体系结合起
15、来的方法, 随后部分血站又更换成 Chiron 的 TMA 技术。各血站根据自身特色, 正在对各种不同的技术组合进行评估, 目的是寻求一种最适合的 NAT 技术 ,既保障血液安全,又能保证血液的及时供给,还要做到省时省力。3.2 国外献血员中 NAT 检测结果从各国公布的 NAT 检出的阳性标本资料总结中可以看出,尽管世界发达国家的血液安全水平已经大幅度提高,但是由于 EIA“窗口期”所致的漏检概率仍然有几百万分之一、几十万分之一甚至几万分之一，具体检测结果见表 2。表 2国外献血员中 NAT 检测结果汇总国家 试剂 检测方式血清学阴性、NAT 单独阳性检出情况 文献美国 Chiron Pro
16、cleix TMA HIV-1/HCV assay;Roche Cobas AmpliScreen HIV-1 and HCV testsChiron: 16 人份，TMA, 化学发光检测；Roche： 24 人份混合，PCR-ELISA1999.03-2002.03: HCV NAT+： 170/39,721,404，即1/ 23 万；HIV-1 NAT+：12/37,164,054，即1/310 万文献 14 日本 Multiplex HBV/HCV/HIV-1 reagent( Roche 与日本共同研制) 1999 年 7 月 1日-2000 年 1月 31 日，500人份；2002 年 2 月 1日起，50 人份混样;合格血液检测1999.72000.4：HBV NAT+：262560977，
