（新编）核酸探针技术在病原微生物检测中的

简述核酸探针技术及其在微生物检测中的应用核酸探针技术及在病原细菌检测中的应用随着分子生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，核酸探针（Nuclear acid probe）以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，已逐步应用于病原微生物的检测。核酸探针是将已知核苷酸序列 DNA 片段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检 DNA 中 ，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的 DNA 区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中 DNA 的目的，这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链 DNA 分子就称为核酸探针或基因探针。根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分为 DNA 探针或RNA 探针，一般大多选用 DNA 探针；根据选用基因的不同分为两种，一种探针能同微生物中全部 DNA 分子中的一部分发生反应，它对某些菌属、菌种、菌株有特异性，另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组 DNA 发生杂交反应，如编码致病性的基因组，它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。这类探针检测的基因相当保守，包括大部分 rRNA，因为他既可能在一种微生物中出现，又可代表一群微生物。如应用 rRNA 探针检测作为筛选食品污染程度的指示菌 E.Coli。选择探针的原则是只能同检测的细菌发生杂交反应，而不受非检菌存在的干扰。1 核酸探针的特点：1.1 探针的特异性 核酸探针检测技术的最大特点是特异性，就是说一个适当组建的DNA 探针能绝对特异性地与所检微生物而不与其他微生物发生反应。对食品检测而言，就是不与样品中内源性杂菌和样品自身 DNA 发生非特异性反应。以往检测方法检测的是基因的表达产物（蛋白质或其他产物） 。检测这种物质受多种因素影响。比如食品中微生物因受应激损伤（高温、冷冻、化学制剂等）会导致基因组的变化，从而引起其表达产物的变化。而核酸探针检测的基因本身，它能识别基因本身的变异，不受基因表达产物的影响。常规免疫学方法检测抗原、抗体，他们都是蛋白质，这些蛋白质由氨基酸组成，而氨基酸由核苷酸序列确定，一旦这种序列受外界影响发生变异，就会导致其产物的变化，影响抗原抗体间的反应，使检测特异性下降。检测病毒主要通过组织培养后，检测病毒相关的蛋白质囊膜，即使采用超低温保存，有时也会引起编码蛋白质囊膜基因的变化，而采取 DNA探针检测病毒则不用改变其蛋白质结构，而只需检测是否有相应特异性的编码蛋白质囊膜的病毒靶 DNA 序列。另外，核酸之间的识别连接比抗原抗体准确，并且探针检测比免疫学方法灵活。尽管看来形成抗原抗体复合物比核酸杂交快，但能通过加磺化葡聚糖把退火速度增加 100 倍，从而提高反应速度，核酸比蛋白质耐受高温（100℃） 、有机溶剂、螯合剂和高浓度工作液的破坏作用，所以用比提取蛋白质强烈的多的方法制备核酸，不会影响杂交反应。当然 RNA 探针除外，因为 RNA 不耐受碱处理，需用其它方法制备检测用RNA。核酸探针的特异性取决于探针的碱基序列和使用条件，如在不严格条件下（低温高盐）探针与靶 DNA 误交结合力比严格条件下稳定。探针长度也会影响反应的特异性，一般加 Formamide 增加反应特异性。1.2 探针的敏感性 研制核酸探针是为了检测出单个病毒和细菌。DNA 探针敏感性取决于探针本身和标记系统。32P 标记物通常可检出 10－8 摩尔特异 DNA 片段，相当于0.5pg，1000 个碱基对的靶系列，相当于 1000－10000 个细菌。用亲和素标记探针检测 1 小时培养物 DNA 含量在 110pg，两者敏感性大致相同，而血清学方法只能达到 1ng 的水平。延长培养时间，增强信号强度能提高探针的敏感性。非放射性物标记探针在高浓度情况下，由于抑制了非特异性吸附，比放射性物标记探针背景干扰小。在探针上加生物素化的核苷酸长尾能使检测敏感性提高 10 倍。细胞中 rRNA 比 rDNA 多，检测 rRNA 比 rDNA 敏感。通过扩增 DNA 含量也能提高检测敏感性。2 核酸探针技术在食源性病原微生物检测上的应用2.1 沙门氏菌 食品中沙门氏菌污染量小，常受应激损伤，不易恢复，现用检测方法得到阴性报告最少需四天，阳性报告还要延迟 2－3 天。研究检测沙门氏菌的探针难度大，因为它拥有 2000 多个血清型，还不清楚它们是否存在共同特异性的致病因子。Fillal 等人从染色体序列和构建的质粒文库中分离到一个适用于沙门氏菌检测的探针。它能和沙门氏菌而不和其他微生物及样品培养基发生非特异性反应。这种用同位素标记的探针，能识别350 株不同的沙门氏菌。由于该方法最小检出量只有 1 个细菌/25 克样品，所以需要增菌培养。AOAC 最近认可了 Gene-Tark 沙门氏菌比色分析法，这种探针标记物为异硫氰酸荧光素（FITC ）,再用辣根过氧化物酶标记抗 FITC 的抗体结合放大探针，在多聚腺苷酸尾部和多聚胸腺嘧啶浸染棒固相薄膜上杂交，对 239 株沙门氏菌的特异性检出率为 100%，假阳性率为 0.8%(BAM/AOAC 培养法假阳性率为 2.2%)。2.2 大肠杆菌 大肠杆菌是食品和水源污染粪便的指示菌。Tark 研制出用浸染棒检测大肠杆菌中 16srRNA 的探针。样品需要前增菌处理，以异硫氰荧光素（FITC）标记探针，再用辣根过氧化物酶标记抗 FITC 抗体检测杂交复合物。 Hsu 等报道其特异性达 100%，假阳性率为 1.2%（目前使用的 BNM/AOAC 法为 23.4%） 。Sander 等构建了一个能检测产生与志贺氏菌毒素相同毒素的大肠杆菌菌株（SLTEC）的探针。增菌后能检测牛肉和其它食品中是否存在有 SLTEC。1990 年 Feng.p 等研制出大肠杆菌 GUD（β－葡萄糖醛酸酶 ）基因的探针，GUD 是 AOAC 认可的 MUG（4－甲基伞形酮 β－葡萄糖醛酸）试验中检测的酶，现用PCR 法扩增 GUD 基因，再用 DNA 探针杂交。MUG 试验既 MUG 在 GUD 作用下释放出 4－甲基7－羟香豆素，它在长波紫外光照射下产生蓝色荧光。2.3 李斯特杆菌 1981 年首次确定它是一种食源性病原菌，1985 年加利福尼亚发生爆发性流行，现用检测方法大多采用冷增菌，费时费力。FDA 于 1987 年最新研制出针对李斯特菌致病基因 β－溶血素的探针，随后 GENE-TARK 研制出商品化检测李斯特菌的 DNA 探针，它能特异性识别细菌的 16SrRNA。该探针是由人工合成的寡核苷酸，用比色法检测样品；需先在 LEB 中培养 16－22h,然后浸染比色检测。2.4 弧菌 国外对 DNA 探针和单克隆抗体法在检测鞭毛方面作了比较，结果发现 DNA探针法阳性检出率高。近年来用 PCR 扩增 DNA 片段，再做探针检测，能检出新鲜龙虾仁中的弧菌，检测灵敏度为 10 个细菌/克，但要用凝胶电泳进一步鉴定。因此不太适合检测食品。1989 年 Olive 构建了一个热稳定溶血素基因的寡核苷酸 DNA 探针检测副溶血弧菌。2.5 弯曲杆菌 检测弯曲杆菌的探针是用非放射性物质标记的。标记物为发光素，靶序列为 rRNA。近年来用碱性磷酸酶标记人工合成的寡核苷酸检测人工污染的粪便样品，检测量为 100000 个菌落形成单位（CPU） ，敏感性和特异性达 100%。2.6 葡萄球菌 大多数检测葡萄球菌的探针是针对肠毒素的，它们能同编码肠毒素有关的基因序列杂交，这类探针能检测肠毒素 A、B、C 和 E。最近，Gene Tark 推出检测金黄色葡萄球菌的探针，方法采用浸染棒比色法，探针检测的基因序列是 23SrRNA。敏感性 100%，假阳性率为 9.3%。