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1、 CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 . 1 简介 . 1 原理： . 1 应用： . 4 技术介绍： . 6 技术优缺点： . 9 简介 CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源 DNA。 CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相应的 CRISPR RNAs（ crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。 CRISPR-CAS 系统的组成主要包括 : 由不连续的重复序列 R( repeat) 与长度相似的间区序列 S( spacers) 间隔排列而
2、成的 CRISPR 簇，前导序列 L( leader) 以及一系列 CRISPR 相关蛋白基因 cas。 Cas蛋白是一种双链 DNA核酸酶，能在 guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与 folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。 原理： 此系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （ trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合 物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具
3、有引导作用的 sgRNA （ short guide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。 作为一种 RNA 导向的 dsDNA 结合蛋白， Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（ unifying factor），能够共定位 RNA、 DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响 Cas9 的结合。因此， Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及 RNA，这为生物体的研究和
4、改造带来巨大潜力。 1. CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在的 PAM（ NGG序列），将临近 PAM 的序列作为候选 protospacer；然后在 CRISPR 基因座的 5端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间 。 2. CRIPSR 基因座的表达 (包括转录和转录后的成熟加工 )： 当该噬菌体再次入侵细菌时， CRISPR 簇首先转录为长的 crRNA 前体，然后逐步被加工成小的成熟的 crRNA。 3. CRISPR/Cas 系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰 crRNA 结合相关的 Cas 蛋白后，形成 crRN
5、A-Cas 蛋白复合体，通过碱基互补配对精确地与目标 DNA相结合，随后 Cas 蛋白对目标 DNA 进行断裂和降解。 4. 应用： 基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过 复杂的打靶载体构建、ES 细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。 2013 年 1 月份，美国两个实验室在 Science杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基
6、因敲除的新方法，该技术与以往的技术不 同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用 到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模
7、型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具 有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。 CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ ZFN）、 ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。 基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对 DNA 序列进行改造的遗传操作技术。 这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断 DNA，切断的
8、DNA在被细胞内的 DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。 通过修复途径，基因组编辑技术可以实现三种基因组改造，即基因敲除，特异突变的引入和定点转基因 。 基因组编辑是研究基因功能的重要手段之一，也可被用 于人类遗传性疾 病的治疗，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点 。 技术介绍： 目前，来自 Streptococcus pyogenes 的 CRISPR-Cas9 系统应用最为广泛。Cas9 蛋白（含 有两个核酸酶结构域，可以分别切割 DNA 两条单链。 Cas9 首先与 crRNA 及 tracrRNA 结合 成复合物，然后通过 PAM 序列结合并侵入 D
9、NA，形成 RNA-DNA 复合结构，进而对目的 DNA 双链进行切割，使 DNA 双链断裂。 由于 PAM 序列结构简单（ 5 -NGG-3） ，几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因 此得到广泛的应用。 CRISPR-Cas9 系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物 细胞，是目前最高效的基因组编辑系统 。 通过基因工程手段对 crRNA 和 tracrRNA 进行改造， 将其连接在一起得到 sgRNA （ single guide RNA） 。融合的 RNA 具有与野生型 RNA 类似的活力，但因为结构得到了简化更方便 研究者使用。 通过将表达 sgRNA 的原件与表达 Cas
10、9 的原件相连接， 得到可以同时表达两者 的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操 作 。 基因敲除的实验过程 1、在把基因序 列中寻找 NGG 序列获得其附近 20 多个碱基的序列，与tracrRNA序列融合，设计出 sgRNA并合成该序列。 2、将该序列以及 cas9基因连入如图所示载体。 3、转化感受态，质粒小提，测序验证。 4、细胞培养与细胞转染 5、敲除效果检测。 6、建立稳定敲除的细胞株 Cas9质粒构建 虽然普通质粒很多时 候也能达到实验效果， 但是质粒转染具有效率低， 作用时间短暂性 等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用 质粒见
11、addgene（ lentiCRISPR v2， lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast） ，慢病毒可以整合入 宿主基因组中，长期稳定的表达（汉恒生物提供 CRISPR/cas9 慢病毒包装） ，但是由于慢病 毒克隆能力有限而 CAS9 本身 分子量比较大（大于 4kb） ，且长期插入可能导致乱切，脱靶 等，同时慢病毒包装最终获得的滴 度不高等原因，腺病毒更有优势，腺病毒克隆能力强， 获 得的病毒滴度也高。同时相对于普通质粒来说，作用是时间也比较长，可以达到更理想的敲 除效果。 技术优缺点： CRISPR （ Clustered Regularly Interspers
12、ed Short Palindromic Repeats）是细 菌用来抵御病毒侵袭 /躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。科学家们利用 RNA引导 Cas9核酸酶可在多种细胞（包括 iPS）的特定的基因组位点上进行切割，修饰。 Rudolf Jaenisch 研究组将 Cas9与 Te1和 Tet2特异的 sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达 80%。 他们将 Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在 ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。与 ZFN/TALEN 相比， CRISPR/Cas 更易于操作，效率更高 ，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。但该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究。 传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。 核酸酶ZFN/TALEN 尤其是 CRISPR/Cas 技术如果能解决脱靶效应的话，有可能会广泛应用于小鼠，大鼠及其他模式动物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。
