《突变的冬虫夏草菌丝体中多糖的提取,纯化及抗肿瘤活性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《突变的冬虫夏草菌丝体中多糖的提取,纯化及抗肿瘤活性研究（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、突变的冬虫夏草菌丝体中多糖的提取，纯化及抗肿瘤活性研究摘要 从突变的冬虫夏草中可大量提取出一种水溶性多糖（命名为 MCMP） ，通过热水提取，利用 sevage 法、乙醇沉淀，阴离子交换和凝胶过滤层析 CL-6B 法脱除蛋白质。该多糖由甘露糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖组成，它们的摩尔比为 59.36:1:8.31:39.50，其平均分子量为 8100。在这项研究中，我们选择喉癌Hep-G2 细胞，Hela 细胞和肾小球系膜细胞来研究该多糖的抗肿瘤活性。MTT 测定结果表明，经 48 小时的培养后，该突变体菌株的多糖对细胞增殖有抑制作用。引言冬虫夏草，最昂贵的中国传统药物之一，被认为是中国罕见的虫
2、草。冬虫夏草具有广泛的药理活性，包括抗炎，镇痛抗氧化，抗血栓生成，常用于补肾、缓解肺部炎症，治疗高血糖，高血脂，肾功能不全和肝脏疾病等。现代医学研究表明，冬虫夏草对人体的几个系统有益，如循环系统、免疫、造血、心血管、呼吸和腺体系统。 然而，时下，冬虫夏草的过度开发导致了野生冬虫夏草的灭绝及土地的荒漠化。培育虫草，而不是传统的恢复冬虫夏草是人们迫切需要的。在中国及东南亚，一般将培育子实体作为原料药和保健食品进行售卖。近年来，科学家们对它的生命周期进行了广泛研究，以期分离出发酵菌株。 从天然冬虫夏草中已分离出几株。木耳栽培技术已被用于培育冬虫夏草，它们显示出类似的药理活性，冬虫夏草可以生产多种生物
3、活性成分如虫草素，D-甘露醇和某些多糖。多糖因其多种多样的生物活性而备受关注，它被广泛地应用在化妆品，药品，食品营养等行业。 研究发现，某些多糖对包膜病毒有抵抗功效，包括HSV-1 病毒，流感病毒和人巨噬细胞病毒，而且具有抗肿瘤活性。冬虫夏草具有多种类型的多糖，已报道它们具有许多令人关注的生物活性，包括免疫刺激，抗肿瘤活性和自由基清除等。中国吉林大学普通生物学中心实验室研究发现，突变冬虫夏草（H4019）高产多糖达 0.780 g / L。因此，本研究的目的是对冬虫夏草 H4019 的多糖进行分离，纯化，表征及抗肿瘤潜能的探究。2.材料和方法2.1 药品a. 琼脂糖凝胶 CL-6B 是从 Ph
4、armacia Biotech 公司购得。b. DEAE-52 纤维素阴离子交换柱是来自 Amersham Biosciences 公司。三氟乙酸（TFA）购自 Merck 公司。c. 3 - （4,5 - 二甲基-2 - 基）-2,5 - 二苯基溴化（ MTT） ，刀豆蛋白 A（刀豆）和脂多糖（LPS ）购自 Sigma 化学公司。d. 作为介质的 RPMI-1640 培养基购自 GIBCO Invitrogen 公司。RMPI-1640 培养基，用于免疫学实验，配有 HEPES 缓冲液 10mol/ml，青霉素 100 IU/mL，链霉素 100 g/ml，L-谷氨酰胺 2mol/ml，2
5、 - 巯基乙醇50mol/L,10的新生牛血清，pH=7.2。e. 所有其他试剂均为可用的最高品质。2.2 细菌培养将原始菌株（CGMCC5.699）在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）斜面上，26下培育 7 天，然后在液体培养基中激活 4 天诱导出高产突变冬虫夏草（H4019） 。种子菌液与浸没液以 4的比例接种到发酵液中，得到真菌菌丝。真菌菌丝体冷冻干燥并收集。用蒽酮-硫酸法以葡萄糖为标准确定总碳水化合物含量。2.3 MCMP 的提取从冬虫夏草中获得的真菌菌丝体，在沸水浴中加热 3.5 小时，并用 4 层纱布过滤。将固体物质在相同条件下萃取两次。合并滤液并离心除去不溶于水的物质。离心（800
6、0r/min，10min）后，将上清液浓缩至 1000mL，加入95（体积分数）乙醇。乙醇最终体积分数为 80。悬浮液在 3000r/min 下离心 10min 后，收集沉淀物，并将其冷冻干燥，得到粗多糖级分。碳水化合物总含量测定。将多糖重新溶解在 1000ml 蒸馏水中，用 Sevag 法(试剂 V 正丁醇 ：V 氯仿 =1:4， 250ml)处理，将其在 5000 r/min 下离心 15 min 以除去蛋白质。The supernatant was dialyzed against deionized water over night before concentration in a
7、vacuum evaporator at 55 C. 将上清液透析去离子水中过夜，用真空蒸发器在55下进行浓缩。将乙醇与样品以 4:1（体积比）进行沉淀，并除去沉淀和溶剂乙醇后，得到冬虫夏草（MCMP）的菌丝体脱蛋白的多糖级分。总碳水化合物的含量确定了。2.4 MCMP 的纯化将 20mgMCMP 溶解在 1ml 的蒸馏水中，用 DEAE-52 纤维素阴离子交换柱（2.6 厘米60 公分）进行离子交换。该柱先用去离子水，然后再用梯度溶液（0.1，0.2 和 0.3mol/L 的 NaCl）分别以 0.5ml/min 的流速进行洗脱。收集级分（5 毫升，每份） ，根据蒽酮-硫酸法确定总碳水化合物
8、含量。糖醛酸的含量用m-羟基法确定。得到的级分浓缩，用蒸馏水透析，然后冷冻干燥。凝胶渗透色谱系统琼脂糖 CL-6B 用于进一步纯化。该柱用的去离子水以 1ml/min 的流速进行。将级分（10ml，每份）收集起来。2.5 多糖分子的测定质量和单糖组成MCMP 的分子量（ Mw）与单糖组成是用高性能液相色谱仪（ HPLC，日本岛津公司）进行测定的，配有 TSK-GEL G3000 PWXL 柱（7.8 毫米300 毫米）和一个 RID-10A 折光检测评价仪。HPLC 法： 将 0.5的 MCMP（20L ）溶解在蒸馏水中，以 0.7的 Na2SO4 为流动相,以 0.5ml/min 的流速在
9、40下进行。用已知的相对分子质量（T-700 ，T-580 ，T-500，T-110 ，T-80，T-40，T-11 和 T-9.3）的 T 系列葡聚糖作为标准进行校准。取 2mg 多糖样品进行水解，用含 1 mol / L 盐酸的无水甲醇，在 80下处理16 小时，然后用 2mol / L 的三氟乙酸（TFA ） ，在 120下保持 1 小时。所得到的水解产物是 1-苯基-3-甲基 -5-吡唑啉酮（PMP）的衍生物，用连接有 Shimadzu HPLC 系统（ LC-10ADVP 泵和 SPD-10AVD UV-Vis 检测器）的 Inertsil ODS-3 色谱柱（4.6 mm150 毫
10、米）进行分析。 将 PMP 的衍生物（20L）注入 HPLC 系统，用 82.0的 PBS（0.1 摩尔 /升，pH 值=7.0 ）和 18.0的乙腈（体积比）以1.0ml/min 的流速进行洗脱，并通过 UV 监测 245nm 下的光谱。2.6 细胞系列喉癌 Hep-G2 细胞，Hela 细胞和系膜细胞从上海生物化学与细胞生物学研究所，中国科学研究院获得。在 RPMI-1640 培养基上培养细胞，该培养基有10热灭活的胎牛血清（FBS ） ，青霉素（100 IU/ml）和链霉素（100mg / L） ，在37 C、潮湿环境下培养，空气中 CO2 的含量为 5%。2.7 体外抗肿瘤试验MCMP
11、 对 HepG-2 细胞，Hela 细胞和肾小球系膜细胞的生长和增殖的抑制效应，是通过 3 -（4,5 - 二甲基-2 -吡啶）-2,5 - 二苯基溴化法（MTT）测定出来的。将密度为 2104 个细胞/ 孔的细胞接种于 96 孔的培养板上。在 37下培养 24 小时后，将实验样品（浓度大约为8000，4000，2000 ，1000，500，250，125 和 62.5g/ml）和控制介质分别加入到各类细胞样品中，每隔 24 小时加一次，培养 72 小时。加入20L（5g/ml）的 MTT 溶液到每个孔中，并将细胞在 37下进一步培养 4 小时。将析出的甲臜用 150L 二甲基亚砜溶解后，在
12、570nm 的波长下测定光密度。MCPC 的抑制率（IR）是通过下面的公式计算：IR(%)=(1 ODexp/ODcon) 100%其中 OD exp 和 OD con 是处理过的和未处理过的细胞的光密度。2.8 统计学分析所有数据均为三次重复试验结果的平均值。统计计算采用 SPSS10.0 版软件（SPSS 公司，芝加哥，美国）进行。应用方差分析方法测定试样结果之间的差异。利用邓肯检验法进行数据的比较。 P 值 0.05 时，认为具有显著差异。3 结果与讨论3.1 多糖的分离与纯化通过乙醇沉淀，从 100g 真菌菌丝体中提取出 2.312g 粗多糖，其多糖含量用蒽酮 - 硫酸法测定为 28.
13、1。通过 DEAE-52 纤维素阴离子交换柱和琼脂糖凝胶 CL-6B 柱提纯，多糖含量达到 99.8，冻干后质量为 320mg。MCMP 的色谱结果见图 1。经过 DEAE-52 纤维素阴离子交换柱分离后，从中获得的 MCMP I和 MCMP II（1:10.6 体积比） 及其含水梯度溶液（去离子水和 0.1，0.2 和0.3mol/LNaCl） 。MCMP I 和 MCMP II 分别是中性多糖和酸性多糖。MCMPII 通过琼脂糖凝胶 CL-6B 柱进一步纯化（图 2） 。MCMPII 只显示一个对称峰。结果表明，样品中没有糖醛酸和其它多糖。利用 DEAE-52 纤维素阴离子交换柱粗多糖的溶
14、出曲线总碳水化合物含量用蒽酮硫酸法测定3.2 多糖分子质量和单糖组成样品经乙醇沉淀后，获得多糖级分。多糖的分子量是 8100。该多糖含有甘露糖，鼠李糖，半乳糖和葡萄糖，根据保留时间和 HPLC（图 3）的峰面积得其摩尔比为 59.36:1:8.31:39.50。用 0.1mol/ L 的去离子水以 1 mL / min 的流速洗脱，用琼脂糖凝胶 CL-6B 柱测定MCMP的纯度利用 HPLC 分析多糖组分3.3 MCMP 的抗肿瘤活性研究体外测定突变体菌株（H4019）的多糖对 HepG-2 细胞，Hela 细胞和系膜细胞的结果见图 4。 从结果中，我们可以看到，该突变体菌株经过 24 小时培
15、养后对肿瘤细胞没有抑制作用。但经过 48 小时培养，用不同浓度的多糖处理的肿瘤细胞表现出明显的受抑制作用，且抑制能力受剂量控制。其抗肿瘤活性与多糖浓度直接相关。经过 72 小时培养，生长抑制率较高。在 8mg/ml 的浓度，MCMP 对 HepG-2 细胞、Hela 细胞和肾小球系膜细胞的抑制率分别为57.11，67.11和 58.74（如图 4）。MCMP（高产突变冬虫夏草菌丝体多糖）的实验结果与原始菌株的多糖比较，表现出对 HepG-2 细胞，Hela 细胞和系膜细胞相对较高的抑制率。经过 72 小时培养，MCMP 对 HepG-2 细胞，Hela 细胞和系膜细胞的 IC50 值分别为5.
16、318，3.192 和 9.644mg/ml。在我们的研究中，突变冬虫夏草产生了比原始菌株明显更多的多糖。相较于原始菌株 0.587g/ L，该突变体冬虫夏草的多糖含量增加到 0.780g/ L 。提取和纯化工艺很容易操作并获得了均匀纯度高的多糖。产量高和纯度高的多糖降低生产成本。我们研究了 MCMP 对 HepG-2 细胞，Hela 细胞和系膜细胞的抑制活性，结果表明细胞增殖率得到有效抑制。因此，冬虫夏草可广泛治疗肿瘤，这是有根据的报道。冬虫夏草将是一种治疗肝癌，宫颈癌，肾炎和其它相关疾病的潜在药物。4 结论在这项工作中，水溶性多糖（MCMP）是从高产突变冬虫夏草菌丝体中分离得到的，其含甘露糖，鼠李糖，半乳糖和葡萄糖的摩尔比为59.36:1:8.31:39.50。用突变体菌株的多糖培养 48 小时后，其抗肿瘤活性可抑制 Hep-G2 细胞，Hela 细胞和系膜细胞，它将是治疗肿瘤的潜在药物。
