《转染Smad3基因的大鼠肾系膜细胞uPA及PAI1表达的改变》由会员分享，可在线阅读，更多相关《转染Smad3基因的大鼠肾系膜细胞uPA及PAI1表达的改变（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1转染 Smad3 基因的大鼠肾系膜细胞 uPA 及PAI1 表达的改变【摘要】 通过对大鼠肾小球系膜细胞（ MsC）转染 Smad3 基因，观察转染阳性细胞克隆尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及纤溶酶原激活物抑制因子1(PAI1) 表达的改变，以进一步阐明转移生长因子（ TGF）介导肾小球硬化发生的作用机制。方法： 经脂质体介导将含有 Smad3 重组表达质粒转染大鼠 MsC，用 G418 筛选及RTPCR，Western blot 法鉴定；又分别采用 RTPCR 与Western blot 法，检测转染阳性细胞克隆 uPA 及 PAI1 表达改变。结果： 成功建立高表达 Smad3 的阳性
2、 MsC 克隆（Th8 ，Th15 ） ，并证实其 uPA mRNA 及蛋白表达明显降低，而 PAI1 mRNA 及其蛋白的表达显著增加。结论： TGF 可能通过上调 Smad3 而减少组织内 uPA 的生成和增加 PAI1 的合成，从而促进肾小球硬化的进展。 【关键词】 系膜细胞 Smad3 尿激酶型纤溶酶原激活物 纤溶酶原激活物抑制因子1 Abstract Objective: To elucidate the mechanism of the role of TGF in the development of glomerulosclerosis by observing urokina
3、setype plasminogen activator(uPA)and 2plasminogen activator inhibitor1(PAI1)expressions on cultured rat mesangial cells(MsC)transfected with Smad3 cDNA. Methods： Lipofectin method was used to transfect Smad3 cDNA into rat MsC, RTPCR and Western blot analysis for detecting Smad3 mRNA and protein expr
4、ession level.The expressions of uPA and PAI1 were also determined by RTPCR and Western blot. Results： Overexpression of Smad3 on two transfected MsC clones (Th8，Th15)were successfully established.Two MsC clones showed decreased expressions of uPA mRNA and its protein accompanied with increased synth
5、esis of PAI1 mRNA and its protein. Conclusion： It is possible that TGF mediates the development of glomerulosclerosis by upregulating Smad3 expression, which decreasing the expression of uPA and increasing the synthesis of PAI1. Key words mesangial cell; Smad3; urokinasetype plasminogen activator pl
6、asminogen activator inhibitor1大量研究表明，转化生长因子 （transforming growth factor,TGF）的作用是介导肾小球硬化发生的共同通路1 。TGF 通过与靶细胞膜上的相关受体（TR ）结合，磷酸化激活3信号转导分子 Smad2 和 Smad3 后与 Smad4 形成异聚体转移至核内，并在核内相关因子的共同作用下，参与对一些靶基因表达的调节2 。体外培养的肾小球系膜细胞（ mesangial cell,MsC）有Smad2，Smad3 和 Smad4 存在，可被 TGF1 激活并参与纤溶酶原激活物抑制因子1 （plasminogen acti
7、vator inhibitor1，PAI1 ）及型胶原的转录过程3,4 。最近我们运用细胞转基因技术发现 Smad7 介导了肾小球 MsC 基质降解酶系统代谢过程，且其可能为阻止肾小球硬化发生的重要机制5 。本实验将 Smad3 cDNA 重组质粒经脂质体介导转染大鼠 MsC，观察转基因 MsC 克隆尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinasetype plasminogen activator,uPA)及 PAI1 的表达，以进一步阐明TGF 介导肾小球硬化发生的作用机制。1 材料和方法1.1 重组 Smad3 真核表达质粒的鉴定与超纯质粒的制备pcDNA3.0Smad3（日本 Dr.Take
8、shi Imamuna 馈赠）经EcoR和 Xho 双酶切及 EcoR单酶切鉴定，送测序（联合基因公司）后大量扩增，QIAGEN Kit 纯化。1.2 Smad3 基因对 MsC 转染和阳性细胞克隆的筛选4实验用 MsC 为第 8 代，其制备及鉴定可参阅已报道的常规方法6 。融合生长的细胞以 1106 细胞数转入 6 孔板内，到呈现30%50%融合生长时，弃完全培养液，分别加含有Lipofectin(Gibcobrl 公司) 和 pcDNA3.0Smad3 或 Lipofectin 和pcDNA3.0 混合液的无血清培养液（ Sigma 公司）1 ml，20 h 后弃无血清培养液，加入含 20
9、%血清的完全培养液，72 h 后再改用含G418（600 g/ml，Gibcobrl 公司）的完全培养液。20 d 后克隆形成，将其种入 24 孔板中，直至生长至融合，再转入 6 孔板，最后转入 100 ml 培养瓶中。1.3 对含有 Smad3 MsC 克隆的鉴定1.3.1 RTPCR 法 阳性克隆细胞生长至亚融合时，用Trizol（Gibcobrl 公司）抽提总 RNA，反转录成cDNA（Promega 公司）,等量 cDNA 依照 Advantage cDNA PCR kit(Clontech 公司)提供的步骤进行 PCR。其引物如下：内参照GAPDH（上游 5ACCACAGTCCATG
10、CCATGCCATCAC3;下游5CCACCACCCTGTTGCTGTAG3，预计扩增片段长度为 450 bp） 。 Smad3(上游 5TCTTGTGTCTAAGAGAGTTGA3; 下游5TCCAGTCCAGGAGAAAGGCAC3，预计扩增片段长度为 363 bp)。51.3.2 Western blot 法 阳性细胞克隆生长至亚融合时，弃完全培养液，PBS 洗 2 次，20 l 蛋白依标准方法进行 8%SDSPAGE变性电泳，转移至 PVDF 膜。一抗为山羊抗小鼠 Smad3 多克隆抗体（1200，Oncogene 公司） ，二抗为生物素化兔抗山羊IgG（ 1500，ABC Kit）
11、。1.4 RTPCR 法检测 uPA 与 PAI1 mRNA阳性细胞克隆生长至亚融合时，用 Trizol（Gibcobrl 公司）抽提总 RNA，反转录成 cDNA（Promega 公司） ,等量 cDNA 依照Advantage cDNA PCR kit(Clontech 公司)提供的步骤进行PCR。PCR 引物如下：内参照 GAPDH 同上。 uPA(上游5AATCGAACTGTGGCTGTC3; 下游5ATCCCTCTTTCTTCTCAAGG3，预计扩增片段长度为 406 bp)。PAI1（上游 5CCTCTCCGCCATCACCAACA3；下游5TGTGCCGCTCTCGTTCACCT
12、3，预计扩增片段长度为 261 bp） 。1.5 Western blot 法检测 uPA 与 PAI1 蛋白阳性细胞克隆生长至亚融合时，弃完全培养液，PBS 洗 3 次，6取 20 l 蛋白依标准方法分别作 8% SDSPAGE 变性电泳，转移至PVDF 膜。一抗分别为鼠抗人 uPA 多克隆抗体 (1200，复旦大学朱运松教授馈赠)及鼠抗人 PAI1 单克隆抗体 (1200，Oncogene公司)，二抗分别为生物素化马抗鼠 IgG（1500，ABC Kit） 。1.6 定量和统计分析用 Kodak Digital Science 1D 测定条带的积分光密度，经 SPSS 9.0 统计软件对数
13、据进行标准差计算和 t 检验。2 结 果2.1 重组真核表达质粒 pcDNA3.0Smad3 的鉴定经 EcoR和 Xho双酶切及 EcoR 单酶切鉴定，证明 Smad3基因已被正确地重组至 pcDNA3.0 载体中(图 1)，其两端测序结果显示, 与基因库中大鼠 Smad3 序列完全一致。2.2 转染 Smad3 cDNA 的 MsC 鉴定转染的 MsC 经 G418 筛选后，共获得 32 个克隆。RTPCR 结果显示，Th8 与 Th15 阳性细胞克隆 Smad3 mRNA 的表达显著增高（图 2） 。Western blot 结果显示，Th8 与 Th15 细胞克隆7Smad3 蛋白表达
14、明显增高，显示相对分子质量约为 48 000 蛋白条带（图 3） 。2.3 阳性 MsC 克隆 uPA mRNA 与蛋白表达的改变经 RTPCR 检测，Th8 与 Th15 细胞克隆 uPA mRNA 的表达明显降低（图 4） 。 Western blot 结果显示，其 uPA 蛋白表达比对照组降低约 48%，其相对分子质量为 50 000(图 5)。2.4 阳性 MsC 克隆 PAI1 mRNA 与蛋白表达的改变经 RTPCR 检测，Th8 与 Th15 细胞克隆 PAI1 mRNA 的表达明显增加（图 6） 。Western blot 结果显示，其 PAI1 蛋白表达比对照组高约 2.3
15、倍，其相对分子质量为 45 000(图 7)。3 讨 论大量实验研究表明，细胞外基质（extraccellular matrix,ECM）在肾小球内的沉积并导致肾小球硬化的发生，是基质降解酶及其组织内抑制物失衡所致，其中纤溶酶及其抑制剂是参与肾小球硬化过程的一个重要降解酶系统。研究证实，PAs 分为组织型（tPA ）和尿激酶型（uPA）两种，它们均可激活纤溶酶原（plasminogen）,8使之转变为纤溶酶（plasmin） ，后者可降解多种 ECM 成分（如纤连蛋白、波形蛋白等） ，同时还能使非活性形式的 MMP2 转变为活性型，提高其降解 ECM 能力。其中 uPA 在 ECM 降解和重塑
16、过程中发挥了极其重要的作用。而 PAI1 则是 uPA 和 tPA 的天然抑制剂, 通过形成复合物而使 uPA 和 tPA 失去活性，促进 ECM 在肾小球内的沉积及肾小球硬化过程的进展。大量研究证实，人类多种肾小球疾病，如系膜增生型肾小球肾炎、新月体型肾小球肾炎、局灶节段性肾小球硬化等，均伴随 TGF 表达增加。有作者运用细胞转基因技术发现，过表达 TGF1 的大鼠 MsC PAI1 mRNA 及其蛋白表达增加，而低表达 TGF1 的大鼠 MsC PAI1 mRNA 及其蛋白表达降低7 。目前对于 TGF 信号转导通路下游重要的信号转导分子 Smad家族的实验研究，已成为探讨其促进肾小球损伤和硬化作用机
