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1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询慢性庆大霉素损伤后豚鼠前庭感觉上皮蛋白激酶 C表达和活性作者：马晓莉 姜鸿彦 黄维国 邱建华 王锦玲 刘顺利 【关键词】 庆大霉素 关键词: 庆大霉素;前庭;感觉上皮;蛋白激酶 C;豚鼠 摘 要:目的 研究庆大霉素慢性损伤后豚鼠前庭终器蛋白激酶C（PKC）活性的变化及其 ， ， 亚型的表达，探讨 PKC与前庭损伤修复的关系. 方法 采用免疫细胞化学法观察椭圆囊斑、球囊斑和壶腹嵴 PKC， ， 亚型的表达;应用 -32 P 示踪检测前庭终器 PKC 活性的变化. 结果 PKC ， ， 亚型在前庭感觉上皮细胞均呈阳性表达，上皮下结缔组织呈阴性表达
2、. ， 亚型较 1 亚型表达稍弱，不同亚型抗原分布不完全相同.与对照组相比，PKC ， 在停止注射庆大霉素后 1d 其表达明显减弱，随后其表达逐渐增加，至 1wk 其表达已高于对照组，3wk 仍未恢复.PKC 表达各组变化不明显.豚鼠前庭终器 PKC 活性检测结果与 PKC ， 表达变化规律基本相似. 结论 庆大霉素慢性中毒后豚鼠前庭感觉上皮 PKC ， 亚型表达及 PKC 活性均发生变化，且不同亚型抗原分布不完全相同.提示 PKC 在前庭感觉上皮损伤修复过程中发挥重要作用，不同亚型可能具有不同的作用. 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询Keywords:gentamicin
3、s;vestibule;epithelium;protein ki-nase C;guinea pigs Abstract:AIM To investigate the PKC expression and ac-tivity after chronic gentamicin toxicity in vestibular terminal organs of guinea pigs and to study the relations between PKC and injury repair process of vestibule.METHODS By using immunohistoc
4、hemical method，the expressions of PKC and PKCwere examined in ginea pig macula utriculus，macula sacculus and crista ampullaris.The-32 P was used as a tracer to measure the activity of PKC in vestibular terminal organs.RESULTS The positive expression of PKC isoforms， andwas detected in vestibular sen
5、sory epithelium.There was negative staining in connective tissue lying under epithe-lium.The stain of PKC isoforms andwas weaker than that of PKC .The antigen distributions of different PKC isoforms were different.In comparison with control group，the expression of PKC anddecreased at1d after injecti
6、on of gentamicin and then it increased gradually.The expression 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询was obviously higher than control group at1wk after injec-tion and it still did not recover at3wk after injection.There were no obvious differences in expressions of PKC among different groups.The change trend
7、of PKC activity was simi-lar to the expression change of PKC andas a whole.CONCLUSION There were some changes of PKC expres-sion and activity in vestibular terminal organs of guinea pigs after chronic gentamicin toxicity and the antigen distributions of different PKC isoforms were different.PKC may
8、play a significant role in injury repair process of vestibule sensory epithelium and different PKC isoforms may have different physiological functions respectively. 0 引言 前庭毛细胞的损伤是引起前庭系统疾病的主要原因之一.如何促进前庭毛细胞损伤的修复，已成为治疗前庭疾病的关键所在.近年来的研究已经证实前庭毛细胞在受到损伤时会出现凋亡现象，并且毛细胞损伤以后可以部分再生，从而促进前庭结构和功能的恢复1-4 .但是在毛细胞凋亡、增殖
9、和分化过程中，会受到多种因素的影响，这些因素又必须通过复杂的细胞内信号转导通路，将信息传至精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询核，激活或抑制下游基因组的表达才能发挥作用.我们采用免疫细胞化学法观察椭圆囊斑、球囊斑和壶腹嵴 PKC， ， 亚型的表达，并应用 -32 P 标记底物检测前庭终器 PKC 活性的变化，目的在于从胞内信号转导水平探索前庭感觉上皮的损伤修复机制. 1 材料和方法 1.1 材料 青年健康花色豚鼠 44 只，雌雄不拘，耳廓反应灵敏，体质量 350450g，由本校实验动物中心提供.PKC， ， 亚型多克隆抗体购于 Sant Gruz 公司，SABC 试剂盒购于博士
10、德公司，PKC 活性检测试剂盒购于 Gibco 公司，-32 P ATP 由北京市亚辉生物医学工程公司提供，硫酸庆大霉素注射液由本校西京医院制剂中心生产. 1.2 方法 1.2.1 实验分组及前庭损伤动物模型的建立 24 只豚鼠随机分为对照组和实验组，每组 4 只，用于灌注切片;另取 20 只豚鼠行 PKC活性检测，每组 4 只.对照组动物每日 ip 生理盐水 1mL，实验组每日 ip 庆大霉素 150mg kg-1 ，连续 15d.分别于停药后 1，3，7，14和 21d 处死实验组和对照组动物，其中 PKC 活性检测不设 14d 组. 1.2.2 切片的制备 采用 20g L-1 的戊巴比
11、妥钠 30mg kg-1 ip精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询麻醉，40g L-1 多聚甲醛灌注，取出双侧听泡，解剖显微镜下行蜗管内灌注固定，40g L-1 多聚甲醛中继续固定 24h，100g L-1 ED-TANa2 溶液中脱钙 10d，250g L-1 蔗糖溶液中脱水 3d，固定、脱钙、脱水均在 4进行，在其过程中各行真空抽气 10min.组织块在恒低温切片机中用 OCT 包埋，平行于蜗轴切片，每片厚 10m，取经过椭圆囊斑、球囊斑、壶腹嵴的切片行 PKC， ， 亚型免疫组化染色和常规 HE 染色. 1.2.3 免疫组化染色 采用 ABC 法.阳性对照采用豚鼠脑组织，
12、阴性对照以 PBS 代替一抗. 1.2.4 组织样本处理及蛋白激酶粗提物的制备 豚鼠断头处死，迅速取出双侧听泡，解剖显微镜下剥离出椭圆囊、球囊和半规管壶腹，液氮速冻，-80冰箱保存.实验时取出每组 6 只动物共 12 只耳的前庭终器，加入预冷的提取缓冲液（20mmol L-1 Tris，pH7.5，0.5mmol L-1 EDTA，0.5mmol L-1 EGTA，25mg L-1 的亮抑酶肽和抑酶肽） ，冰浴中匀浆，4800r min-1 离心 10min，弃沉淀，继续离心 100000g60min，上清用于测定胞质 PKC 的活性，沉淀加入含 5g L-1 Triton X-100 提取缓
13、冲液，4放置 30min，再离心 100000g60min，上清用于测定膜相 PKC 的活性.蛋白定量用考马斯亮蓝法. 1.2.5 PKC 活性的检测 参照文献5的方法，按照 Gibco 公司 PKC 活性检测试剂盒操作说明书进 行.酶活性以每毫精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询克蛋白每分钟转移的 32 P 的 pmol 数计算（ pmol min-1 mg protein-1 ）. 2 结果 2.1 PKC， ， 亚型免疫组化染色 PKC 在前庭感觉上皮包括基底层的支持细胞和位于腔面的毛细胞染色均呈阳性.胞膜和胞质均有阳性表达，但阳性染色并不均匀，胞膜比胞质表达更强，感觉上
14、皮的底层有小团块状的强阳性表达，包绕在细胞周边.感觉上皮下结缔组织呈阴性表达（Fig1）.与对照组相比，在停止注射庆大霉素后 1d 前庭感觉上皮的胞质和胞膜表达均明显减弱，随后其表达逐渐增加，至 1，2 和 3wk 其表达已高于对照组（Fig24）.PKC 表达和 PKC 表达有所不同，胞膜染色略强于胞质，感觉上皮的顶层表达略强于其底层（Fig5） ，各组内表达相差不显著.PKC 的表达则较弱，胞核着色更深，表达变化规律与 PKC 相似（Fig68）.各组内球囊斑和壶腹嵴与椭圆囊斑染色结果相同. 2.2 PKC 活性变化 豚鼠前庭终器膜相、胞质 PKC 活性在慢性庆大霉素中毒后 1d 均明显下
15、降，3d，1wk 和 3wk 其活性升高，但胞质PKC 活性仍低于对照组，而膜相 PKC 活性高于对照组.总 PKC 活性变化规律与膜相相似（Fig9）. 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询3 讨论 前庭器官体积小，重量轻，直接检测酶活性存在很大难度.本实验将一组内 4 只动物共 8 只耳的前庭终器当作一份标本进行检测，所得结果实际上代表着 8 只耳前庭器的平均酶活性，一定程度上消除了个体差异的影响.PKC， ， 亚型在前庭感觉上皮包括基底层的支持细胞和位于腔面的毛细胞染色均呈阳性，而感觉上皮下结缔组织呈阴性表达，同时进行酶活性检测取材时只带入了非常少量的非前庭感觉上皮组织，
16、因此我们可以认为前庭终器的 PKC 酶活性测定在某种程度上代表了前庭感觉上皮的 PKC 酶活性. PKC 在前庭感觉上皮的底层有小团块状的强阳性表达，包绕在细胞周边.从其位置来看很可能是前庭神经纤维末梢，但不能肯定，尚需进一步证实.PKC， ， 亚型在豚鼠前庭感觉上皮中表达强度和表达模式不完全相同，提示 PKC 不同亚型在其生理活动中发挥着不同的作用. 现在已经了解 PKC 是由一个大基因家族编码的蛋白，至少有 10几种 PKC 的亚型已经被分离鉴定.在细胞培养和体外实验的条件下都证明 PKC 存在于细胞膜和细胞质中，胞质中的呈钝化状态.在细胞中的钙离子浓度稍微升高的情况下 PKC 可以从细胞质转移到特殊部位，如细胞骨架、突触后树突、细胞核和浆膜，而成为待激活态.PKC 与专一激活物结合后发生选择性转位.在 Ca2+ 、磷脂
