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1、1成人结膜干细胞定位特征的免疫组织化学研究【摘要】 目的：研究成人结膜上皮细胞中，粘蛋白5AC（ MUC5AC） ，角蛋白 7，p63 和增殖细胞核抗原（PCNA）的表达及分布情况，探讨成人结膜上皮干细胞的定位特征。方法：获取角膜移植供者的睑球结膜，采用 HE 免疫组化染色法，观察MUC5AC，角蛋白 7，p63 和 PCNA 的表达及分布情况。结果：PCNA 及 p63 表达情况一致，主要表达在睑缘皮肤黏膜交界处及近角膜缘结膜上皮深层细胞。角蛋白 7 在穹窿部球结膜的固有层中的腺体细胞有阳性表达，MUC5AC 在各部位结膜上皮的杯状细胞的胞质阳性表达。结论：MUC5AC 细胞角蛋白 7 和
2、p63 及 PCNA 在成人结膜上皮细胞的特征性表达情况可以推测具有分化潜力的结膜干细胞存在于睑缘皮肤黏膜交界处及近角膜缘球结膜上皮深层细胞。【关键词】 结膜上皮干细胞；定位；免疫组织化学AbstractAIM:To study the expression and distribution of MUC5AC, keratin 7, p63 and proliferating cell nuclear antigen(PCNA) of adult conjunctival epithelial cells to investigate the localization characteris
3、tics of adult conjunctival epithelial stem cells.METHODS: Conjunctiva was 2collected from donor of corneal transplantation. HE immunohistochemical staining were performed to observe the expression and distribution of MUC5AC,keratin 7， p63 and PCNA.RESULTS: PCNA and p63 staining showed similar expres
4、sion pattern，mainly in the deep layer nucleus of palpebral mucocutaneous junction and limbal region. Keratin 7 was positive expressed in the gland cells of lamina propria in the fornix region. MUC5AC was positive expressed in the cytoplasm of goblet cells in various parts of conjunctival epithelium.
5、CONCLUSION:Conjunctival stem cells with high capability of proliferation are mainly located in mucocutaneous junction area and limbus in adult.KEYWORDS: conjunctival epithelial stem cells；localization; immunohistochemistry0 引言眼表存在两类干细胞，角膜上皮干细胞和结膜上皮干细胞，它们属于单能干细胞1，在维持眼表的完整性和泪膜的稳定性中起重要作用。Wei 等2证明了结膜上皮与
6、角膜 角膜缘上皮分别来自各自的干细胞。目前研究显示角膜上皮干细胞存在于角膜缘部，而3对于结膜干细胞的定位研究尚没有定论。我们通过对角蛋白K7，MUC5AC，PCNA 及 P63 成人结膜干细胞不同部位表达情况的免疫组织化学研究，推断成人结膜上皮干细胞的定位特征。1 材料和方法1.1 材料获取角膜移植供者的睑球结膜组织，连眼睑取出完整睑球结膜，除去皮肤及皮下软组织（睑缘保留） ，沿眼球矢状面剪取眼球组织块（呈窄条状，包含全部睑结膜、球结膜、穹隆部结膜及睑结膜与皮肤交接处） ，40g/L 多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，将组织蜡块制成 35m 的切片。1.2 方法组织形态学：取相应切片进行苏木素 伊红
7、(HE)染色,在光学显微镜下观察不同部位上皮细胞的形态特征及周围组织结构,明确睑结膜、球结膜、穹隆部结膜及睑结膜与皮肤交接处所在部位。试剂：一抗为小鼠抗人角蛋白 K7 及 MUC5AC， PCNA，P63 的单克隆抗体 IgG,二抗由 UltraSensitiveTM S2P (Mouse)超敏 SP (鼠)试剂盒提供(福州迈新生物技术有限公司) 。免疫组织化学：取相应切片按4免疫组化 SP 法染色, 按照 SP 试剂盒提供的石蜡切片染色程序进行,切片脱蜡至水,新鲜配制 30mL/L H2O2 室温孵育 10min 以灭活内源性过氧化物酶，修复抗原,将切片放入柠檬酸缓冲液,微波炉加热10min
8、，待其自然冷却后用正常兔血清室温封闭 20min,除去多余血清, 滴加一抗(1150),室温孵育 70min ,PBS 洗 3 次。滴加过氧化物酶标记的链霉亲和素,室温孵育 15min , PBS 洗 3 次，DAB 显色4min ,苏木素复染 ,切片脱水,透明,封闭。采用阴性对照以 PBS 代替一抗，阳性对照采用由迈新公司提供的阳性对照片。K7，MUC5AC， P63 及 PCNA 染色方法及步骤相同。2 结果P63 及 PCNA 在近角膜缘球结膜上皮及睑缘皮肤与结膜交界区域的底层细胞的胞核阳性表达（图 13 ） ， MUC5AC 在各部位结膜上皮的杯状细胞的胞质阳性表达（图 4） ， K7
9、 在穹隆部球结膜的固有层中的腺体细胞阳性表达（图 5） 。3 讨论干细胞是指具有无限或较长期的自我更新能力分化潜能，并能产生至少一种高度分化功能细胞的细胞，具有慢周期性和高度的增生潜能3,是细胞自我更新、增生和分化的源泉3 。眼表存在两类干5细胞，即角膜上皮干细胞和结膜上皮干细胞。目前关于结膜干细胞的定位有以下几种不同的观点：（1）位于穹窿部 4,5;(2)位于皮肤黏膜交界处6,7；(3)弥散分布于穹窿部和球结膜 8；(4)位于睑结膜9。至今没有特异的指标可以确定的鉴别结膜干细胞，目前多利用干细胞的两个显著特征即慢周期和自我更新能力（增生能力）来进行鉴别。我们主要检测了反映细胞增生状态的 PC
10、NA 和 P63，以及角蛋白 K7,黏蛋白 5AC 推测具有潜在增生能力的结膜上皮干细胞可能存在的部位。P63 转录因子属于一个包括两个结构相关蛋白(P53 和 P73)的家族，主要在各种上皮组织的发育、分化和形态发生上起重要作用。Pellegrini 等8 应用 Western Blotting 对培养细胞的 P63 蛋白进行检测，提示 P63 在全细胞克隆（holoclone）表达，而在旁克隆（paraclone）则无明显表达，而全克隆是最具增殖能力的细胞生长方式，超过 95%的构成细胞为未分化细胞，所以有人把 P63 作为未分化细胞的标志来鉴别结膜上皮干细胞10。增殖细胞核抗原（PCNA
11、）参与染色体的复制和修复，Bravo 等首次报道 PCNA 是增殖性细胞的可靠标志 PCNA，即增生细胞核抗原，常用于评价细胞的增生状态，正常组织 PCNA 阳性细胞仅局限于有增生能力的区域，说明有一定数量的活跃干细胞和瞬间增强细胞集中在此部位11。本实验中 PCNA 与 P63 的阳性表达部位一致，都是在近角膜缘球结膜上皮及睑缘皮肤与结膜交界区域的底层细胞阳性表达，而在其他部位不表达，说明在成人结膜中这两个部位的细胞最具增殖能力和6增生活性，结膜干细胞很可能集中在此部位。有学者7研究认为球结膜和睑结膜上皮是两个独立的细胞动力体系，起源于两个干细胞区，即球结膜上皮来源于角膜缘干细胞，而睑结膜上
12、皮起源于皮肤黏膜交界处，这两个部位的结膜干细胞不断分裂增殖成终末细胞，并不断的向穹窿部结膜移动，最后在穹窿部死亡。Wirtschafter 等7 发现在皮肤黏膜交界处稳固聚集 BrdU (52 溴脱氧嘧啶 ) ,且 PCNA 阳性细胞也集中在此区,提示睑皮肤黏膜交界处可能存在结膜上皮干细胞。在本实验中 K7 大量的表达在穹隆部球结膜固有层中的腺体细胞，而在其他部位几乎不表达，可以看出穹窿部的结膜有着大量的腺体，不同于其他部位的结膜。MUC5AC 是泪膜黏蛋白的主要成分, 被认为是杯状细胞的标记物，在本实验中各部位结膜上皮杯状细胞的细胞质中呈淡棕黄色阳性着染，同时从睑结膜和近角膜缘处结膜越向穹窿
13、部 MUC5AC 表达越多，说明穹隆部球结膜含有更多的杯状细胞。综上所述，根据本实验结果，可以推测结膜干细胞可能存在的部位是睑缘皮肤与结膜交界区域和近角膜缘球结膜上皮的底层细胞，这两个部位的结膜干细胞不断分裂增殖成终末细胞，并不断的向穹窿部结膜移动，穹窿部结膜成为“最成熟”的结膜细胞，含有大量的腺体细胞和杯状细胞，并最终在穹窿部死亡。目前干细胞技术在眼科许多领域已经取得许多另人振奋的结果,结膜干细胞的研究也取得了很大的进展，结膜干细胞的准确定位尚需进一步的实验研究，7这一研究对眼表结膜上皮重建，严重眼表疾病的治疗等具有重要意义。【参考文献】1 徐锦堂，孙秉基，方海洲，等.眼表疾病的基础理论与临
14、床.天津：天津科学技术出版社 2002：19322 Wei ZG,Wu RL, Lavker RM, et al. In vitro growth and differentiation of rabbit bulbar, fornix, and palpebral conjunctival epithelia. Implications on conjunctival epithelial transdifferentiation and stem cells. Invest OphthalmolVis Sci 1993;34(5):181418283 裴雪涛. 干细胞生物学 .北京:科学出
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