微波辐照对大鼠海马COXI、IV基因表达影响-2016年最新医学论文

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1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询微波辐照对大鼠海马 COXI、IV 基因表达影响【关键词】 微波；海马；细胞色素 C 氧化酶；能量代谢摘要：目的 研究微波辐照后大鼠海马组织细胞色素 C 氧化酶(COX)亚基 I、IV mRNA 表达变化和对酶活性的影响，探讨微波辐照对大鼠海马能量代谢影响的机制。方法 采用 RT-PCR 法检测微波辐照后海马组织 COXI、IV mRNA 水平，采用还原细胞色素 C 法和高效液相色谱法(HPIC)分别检测微波辐照后海马组织细胞色素 C 氧化酶活性和三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)含量。结果 微波辐照后，大鼠海马

2、组织细胞色素 C 氧化酶活性和 ATP 含量明显降低，并与 COXI、IV mRNA 表达变化呈一致性。结论 微波辐照可影响大鼠海马 COXI、IV mRNA 表达而降低酶的活性，进而引起能量代谢障碍。关键词： 微波；海马；细胞色素 C 氧化酶；能量代谢Effect of microwave exposure on COXI and COXIV mRNA expression in hippocampus of rats 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询Abstract： Objective To study mRNA expression of cytochrome c

3、oxidase (COX) subunit , and activity of cytochrome c oxidase in hippocampus of rats after microwave exposure,and to interpret the molecular mechanism of microwave exposure on the energy metabolism deficit in hippocampus of rats.Methods The expression of cytochrome c oxidase subunit and mRNA after mi

4、crowave exposure was detected by RT-PCR.The content of adenosine triphosphate(ATP),adenosine diphosphate(ADP),adenosine monophosphate(AMP) and activity of cytochrome c oxidase in hippocampus were detected by high performance liquid chromatography (HPLC) and reduced cytochrome c methods respectively.

5、Results Decreased activity of cytochrome c oxidase and content of ATP in hippocampus were found after exposure,cytochrome c oxidase subunit and mRNA was also downregulated.Conclusion Microwave irradiation can decrease the expression of COXI, mRNA and avtivity of COX,and further to induce energy meta

6、bolism deficit in hippocampus of rats.精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询Key words： microwave;hippocampus;cytochrome c oxidase;energy metabolism现代生活与微波技术的应用密切相关，由此导致的环境污染问题已引起了广泛关注。本研究选择在细胞色素 C 氧化酶(COX)活性中起主要作用的催化亚基和调节亚基为观察指标，观察微波对 COX活性和基因表达的影响，以期探讨微波辐照致大鼠海马能量代谢改变的分子机制。1 材料与方法11 材料 (1) 实验动物：健康雄性 Wistar 大鼠(第

7、三军医大学动物室)，体重 180220g。(2) 分组：随机分为对照组、微波辐照组。辐照组具体分为辐照后即刻，3，6，12h 4 个观察组，对照组及辐照各组均为 12 只大鼠，共 60 只。(3) 仪器：PCR 仪(美国 MJ 公司)；凝胶成像系统(美国 BIO-RAD 公司)；Du 640 紫外分光光度计(德国Beckman 公司)；高效液相色谱仪(日本岛津公司)。(4) 试剂：COXI引物(上游：5GCTGCTAATACTGGCAGTGAGA3，下游：5GCTTCGGAAACTGACTTGTACC3，扩增片段约 381 bp)；COXIV 引物(上游：5GGCAGCAGTGGCAGAATG

8、TTGG3,下游：精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询5ACAAGCGCAGTGAAGCCGATGA3,扩增片段约 364bp)；内参actin(上游：5TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT3,下游：5CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC3，扩增片段约 241bp)，所有引物由上海 Sangon 公司合成。ATPNa2、ADPNa2、Cytc(美国 Sigma 公司)。12 方法121 动物辐照 动物置于可透谢微波的专用辐照盒内，在反射近似零的辐照暗室接受全身一次性辐照 20min，辐照环境温度和湿度用设备保持恒定，温度(182)，湿度 50%70%，对

9、照组除不接受辐照原的作用外其他处理条件与辐照组一样。1.2.2 海马组织腺嘌呤核苷酸测定1 将大鼠断头处死，冰浴条件下分离海马，准确称重，按 20l/mg 组织加入预冷的 02mol/L高氰酸匀浆，4，18000g 离心 15min，上清液用 1mol/L 碳酸钾中和并调 pH 至 6570，重复离心 1 次，取上清液作高效液相色谱分析，采用公式 EC(energy charge,EC)=(ATP+05ADP)/(ATP+ADP+AMP)计算能荷。精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询123 海马组织 COX 活性测定2 冰浴条件分离海马，将一侧海马准确称重，按 100mg/ml

10、 加入 10mmol/L 预冷的磷酸钠缓冲液匀浆备用。取还原纯化好的 015mmol/L 细胞色素 C05ml,加入 10mmol/L磷酸钠缓冲液 24ml 摇匀，在 37，波长 550nm 测吸光度(A)值，然后加入 01ml 组织匀浆液，立即开始记时，随后每隔 30s 测定 1 次，最后加入饱和铁氰化钾 1 滴测 A 值，以最小二乘法计算经原点求其斜率 k 值，即为细胞色素 C 氧化速率常数，代表细胞色素 C 氧化酶活性。124 RT-PCR 检测大鼠海马 COXI、COXIV mRNA 表达 各组大鼠腹腔注射 2%戊巴比妥(30mg/kg)麻醉，取海马，提取 RNA，进行 RT-PCR

11、测定。COXI 循环参数。95 30s,5630s,72 1min,循环 31次，72 5min;COXIV 循环参数：95 30s,61 30s,72 1min，循环 40 次，72 5min；-actin 循环参数：95 30s,56 30s,72 1min，循环 31 次，725min；PCR 产物行 15%琼脂糖凝胶电泳。125 图像分析 将电泳凝胶置于 Gel Doc 2000 凝胶图像分析系统，精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询扫描测得 PCR 电泳条带的吸光度值，结果以各检测基因与自身 -actin 条带吸光度比值表示。上一页 1 2 下一页13 统计分析 采用

12、 SPSS 100 软件进行 t 检验。2 结果21 微波辐照对能量代谢的影响(表 1) 大鼠海马组织 ATP 含量在微波辐照后即刻，3，6，12h 与对照组相比分别下降 85%(P005),223%(P001)，227%(P0.01)，334%(P001)。微波辐照后各时相点海马组织能荷(EC)显著低于对照组。海马组织 ADP 含量在辐照后12h 升高(P005)。表 1 微波辐照后不同时相点海马组织高能磷酸盐的含量（略）注：与对照组比较，*P005,*P001精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询22 微波辐照后细胞色素 C 氧化酶活性变化(表 2) 微波辐照后即刻，3，6，

13、12h 海马组织 COX 活性显著下降(P001)，分别为对照组的 734%，625%，609%，453%。表 2 微波辐照后不同时相点海马组织 COX 活性变化（略）注：与对照组比较，*P001；k 为细胞素 C 氧化速率常数23 微波辐照对 COXI mRNA 表达的影响(图 1) COXI RT-PCR 扩增产物电泳结果显示，扩增片段长度为 381bp，与预期的目的片段相同。大鼠海马组织 COXI mRNA 表达在微波辐照后即刻，3，6,12h 逐渐下降并明显低于对照组(P001)，其在辐照后即刻，3,6,12h 分别为对照组的 872%，762%,781%,720%。C:对照；M:ma

14、rker精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询图 1 微波辐照后 COXI mRNA 表达变化(RT-PCR)（略）24 微波辐照对 COXIV mRNA 表达的影响(图 2) COXIV RT-PCR 扩增产物电泳结果显示，扩增片段长度为 364bp，与预期的目的片段相同。大鼠海马组织 COXIV mRNA 表达在微波辐照后 3h 开始下降(P005)，在 6，12h 明显下降(P001)，其在辐照后即刻，3，6，12h 分别为对照组的 926%，884%，876%，868%。C:对照；M:marker图 2 微波辐照后 COXIV mRNA 表达变化(RT-PCR)（略）3

15、讨论本实验表明，微波辐照使大鼠海马组织 COX 活性下降并可导致严重的能量代谢障碍，提示微波可影响线粒体的功能。COX 是线粒体精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询呼吸链电子传递的终末复合酶，是线粒体氧化能力的关键调节部位3 。哺乳动物 COX 由 13 个亚基组成，其中、大亚基由线粒体基因组编码，具有酶的催化活性4 。其余 10 个小亚基由细胞核基因组编码，对酶的活性具有调节作用。在稳定状态下，两基因组编码的亚基在转录、翻译及调节水平具有协同表达效应5，6 。本实验结果表明，海马组织 COXI mRNA 表达在辐照后各时相点明显下降，COXIV mRNA 表达在照后 3h 开

16、始下降，在辐照后 6，12 h 明显下降，提示微波对线粒体基因组和核基因组编码亚基在转录水平上可能具有协同损伤效应，微波辐照后 COXI 和 COXIV mRNA 表达变化和 COX 活性变化相一致，与 ATP 变化相吻合。结果表明，微波辐照可通过对线粒体基因组和核基因组编码亚基在基因转录水平上的损伤影响酶亚基的表达，导致酶的活性下降，最终引起能量代谢障碍。参考文献1 邓锋，刘昭荣，吴小红，等.高压液相色谱检测低氧对大鼠脑组织中腺苷酸含量J.解放军预防医学杂志，1996，3：185-188.精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询2 Ostermeier C,Iwata S,Michel H.Cytochrome c oxidaseJ.Curr Opin Struct Biol,1996,6(4):460-466.3