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1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询微小隐孢子虫免疫保护性基因的研究进展【关键词】 微小隐孢子虫；免疫保护；基因 隐孢子虫（Cryptosporidium）是属于原生动物界的营寄生生活的单细胞原虫。迄今报道过的隐孢子虫虫种有：微小隐孢子虫（C.parvum）,小鼠隐孢子虫（C.muris）, 火鸡隐孢子虫（C.meleagridis）,蛇隐孢子虫（C.serpentis）,鱼隐孢子虫（C.nasorum）等，对人和大多数脊椎动物造成感染的主要是Tyzzer于 19121年发现的微小隐孢子虫（C.p.） 。微小隐孢子虫是一种重要的呈世界性分布的机会性致病原虫,可引起人畜共患的隐孢
2、子虫病(cryptosporidiosis)。免疫力正常的人感染此虫后,虽可引起急性腹泻,但常为自限性；免疫力低下、功能缺陷或免疫抑制的患者感染此虫后,则可引起严重胃肠炎并伴有水样腹泻,导致大量体液丢失而危及生命。该病已被确定为引起人类腹泻的六大病因之一,并且隐孢子虫在艾滋病患者中的感染率高达 48%，长期的严重腹泻，是艾滋病病人的重要致死因素之一2 。世界范围内曾因水源的污染而造成多起隐孢子虫病的暴发流行3 ，对人类公共卫生造成很大威胁。 自从发现隐孢子虫以来，许多研究者一直致力于该病的防治研究，但目前对该病尚无有效的防治措施，因此研究对该病的早期诊断、治疗以及预防的疫苗就显得尤为重要。隐孢
3、子虫生活史复杂,各期均有与致病和免疫有关的抗原蛋白，寻找有效的保护性抗原成分及其基因是微小隐孢子虫疫苗研究的基础。研究者在其基因功能方面已精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询作了大量的研究，目前提交到 GenBank的 DNA序列已有 4 000多个。对编码隐孢子虫蛋白基因的研究发现，可能作为微小隐孢子虫疫苗的基因可分为 7类：细胞骨架成分(cytoskeletal components)、核蛋白(nuclear proteins)、酶(enzymes)、RNA 翻译因子(translation factors)、热休克蛋白(heat shock proteins)、卵囊壁成分
4、(oocysts wall component)和表面抗原与微线抗原(surface antigen and micronemal protein)4 。在上述基因中编码子孢子表面抗原(如 cp23、cp15、cp15/60 等)的基因被公认为疫苗的候选基因。该文就当前研究者筛选的可能有免疫保护性的基因片段的研究进展作一综述。 1 cp23基因的研究进展 对 cp23基因最初报道是 1996年，Perryman 等5从微小隐孢子虫的 cDNA文库中克隆出一个编码 23 kD糖蛋白(子孢子表面蛋白cp23)的基因序列（GenBank 编号 U34390） ，其开放读码框架为 333 bp，编码
5、111个氨基酸，预计氨基酸序列含有一个 N 糖基化位点，但缺少螺旋疏水区域，抗原决定簇分析揭示抗 cp23的单克隆抗体C6B6和 7D10分别识别其不同的表位,前者识别六聚物谷氨酰胺 天冬氨酸 赖氨酸 脯氨酸 丙氨酸 天冬氨酸(QDKPAD)的线性表位，它在 cp23 C末端的 27个氨基酸残基中出现两次；后者识别由该 27个氨基酸残基共同构成的构象表位。经 Western blotting分析表明cp23蛋白和阳性血清中的 IgG1和 IgA反应强烈，通过单克隆抗体C6B6检测，cp23 蛋白定位于子孢子表面,它是诱导保护性免疫力的精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询主要成分
6、，是最佳的核酸疫苗候选抗原。已发现抗该蛋白的单克隆抗体可以明显抑制感染，重组的 cp23蛋白亦可诱导产生保护性抗体。Priest等6根据 Perryman等报道的序列设计了引物，扩增了该片段，用定向克隆法构建在 pGEX4T2 表达载体中，转化到 E.coli HB101，进行了表达，得到了 43 kD的融合蛋白，并用此蛋白进行了ELISA分析。结果发现，重组 cp23抗原 ELISA与灵敏度高的免疫印迹法有很好的一致性，灵敏度和特异度分别为 90%和 92%，以免疫印迹法作为“金标准” ，重组 cp23抗原 ELISA比普遍采用的粗卵囊抗原 ELISA法敏感性更高，这种方法在将来的流行病学研
7、究中更为有用。Eisenberg 等7选择 33名男性艾滋病患者，以其中确诊为隐孢子虫病的 11人为实验组，另 22人（分为两组）为对照组，分别用重组的 cp23蛋白和从卵囊分离纯化的 TX17为抗原对他们做ELISA检测，结果显示，用 cp23抗原时，隐孢子虫病后的血清样本中的 IgG中位数值及诊断前后 IgG的净增长值，在实验组（1 334 U）与对照组（329 U）有明显差异；而用 TX17抗原时，两组 IgG中位数值无明显差异，但 IgG净增长值有明显差异。该结果表明，cp23是一种重要抗原，可用于 HIV感染者的隐孢子虫病流行病学和自然病程的研究。1999 年，Perryman 等8
8、用含有 cp23中和表位的重组蛋白 rC7免疫妊娠晚期的母牛获得了高免疫牛初乳,人工感染C.p.卵囊的小牛服高免疫牛初乳后,未出现腹泻且卵囊排出量显著减少。这表明含有中和表位的重组蛋白可作为预防和治疗隐孢子虫病的候选疫苗。 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询2 cp15/60基因片断的研究进展 cp15/60抗原是另一种活性较高的表面抗原。Jenkins 等9用大鼠抗 C.p.天然 15 kD蛋白的抗血清进行核苷酸序列分析表明，cp15/60 cDNA片段长度为 601bp，不带有起始密码子，但有一终止TAA和一段 poly A长尾，从开读框架推测其可编码 183个氨基酸，其
9、中 1到 27位氨基酸为信号肽序列，36 到 57位为跨膜区序列，3537 位及 154156 位各有在 1个 N 连接的糖基化位点。用纯化的 cp15/60重组蛋白免疫小鼠得到的特异性抗血清，在 Western blotting中可识别天然 15 kD和 60 kD子孢子蛋白，在 IFA中特异抗体与子孢子表面及内部的抗原反应。cp15/60 重组蛋白经 Western blotting证实可被 C.p.感染恢复期牛血清及高效价免疫牛初乳识别。因此可推测，该重组蛋白可用于免疫母牛制备高效价免疫牛初乳（HBC） ，对人与牛隐孢子虫病进行免疫。 实验表明，cp15/60 基因也是诱导保护性免疫力的
10、主要成分，是微小隐孢子虫病疫苗候选分子之一。Sagodira 等10用 cp15/60的 DNA疫苗滴鼻免疫小鼠，可诱导小鼠在肠及血液内持续产生特异性 IgA和 IgG(312 个月)，并诱导脾脏及肠系膜淋巴结产生 IgA诱导的 ADCC应答。国内何宏轩等11用重组质粒 pcDNA315/60 经鼻粘膜接种 BALB/c小鼠，采用淋巴细胞转化实验、流式细胞仪、ELISA和免疫组化染色法检测了其诱导的系统和粘膜免疫反应，并在免疫后经口接种微小隐孢子虫卵囊。结果发现 CD4+、CD8+ T细胞增加，血清中 IgG和小肠液中 IgA滴度分别提高了 0.680.06和精品文档欢迎来主页查询更多精品文档
11、,欢迎来我主页查询0.770.05(P0.01)， 实验组小鼠排出卵囊减少了 70%左右，排卵囊时间缩短了 4.5 d(P0.05)。研究表明重组质粒诱导机体产生多种免疫反应，并且产生了保护力。 3 对热休克蛋白的研究 热休克蛋白(heat shock proteins，HSP)基因也可作为诊断和预防疫苗基因，其中 HSP70 是一类最保守、最重要的 HSP 家族，包括相对分子质量（Mr）为 68 000、72 000、73 000、75 000、78 000 等的 20 多种蛋白，它们几乎在所有生物出现应激时被高度诱导表达，广泛参与各种保护机体和细胞的功能12 。研究发现寄生虫在感染宿主时，
12、生存环境发生改变，寄生虫因处于应激状态而产生HSP。产生的 HSP 在寄生虫虫体分化、增强虫体毒力和逃避宿主免疫攻击等方面具有重要作用。同时，热休克蛋白在促进抗原呈递，激发机体产生免疫应答方面具有重要功能。刘海鹏13等对安式隐孢子虫的 Mr 70 000 热休克蛋白（CaHSP70）的部分编码基因经反转录 PCR、克隆，表达出 rCaHSP70，免疫 C57BL/6 小鼠与 BALB/c 小鼠，其血清特异性抗体滴度均显著高于免疫前。进一步实验显示,rCaHSP70 蛋白可以识别微小隐孢子虫感染儿童血清的特异性抗体，提示安氏隐孢子虫与微小隐孢子虫 HSP70 由于氨基酸序列的保守性，可能存在共同
13、表位，从而发生交叉反应。因此，关于 HSP70在隐孢子虫病的免疫诊断价值和免疫学作用值得进一步深入研究。 上一页 1 2下一页精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询总之，目前对隐孢子虫基因的研究已经取得了很大的进展, 但对其深入、系统的研究还相对不足。随着新思维、新技术方法的发展，有些内容已逐渐深入,其中对微小隐孢子虫基因组的测序工作已经完成,结果显示微小隐孢子虫含有 8 条染色体,基因组大小为911Mbp ,含有 3807 个基因14 。近期,国内姚龙泉等15报道了微小隐孢子虫 T7 噬菌体展示文库, 此系统有助于功能基因的构建和筛查,使研究者更有可能发现“沧海一粟”的目标分子
14、。这些研究将为筛选微小隐孢子虫保护性抗原基因,以及发现有开发潜力的生物制剂分子打下重要基础。 【参考文献】 1 Tyzzer EE.Cryptosporidium parvum(sp.nov),a coccidium found in the small intestine of the common mouseJ.Arch Protistenk,1992,26: 394412. 2 ODonoghue PJ.Cryptosporidium and cryptosporidiosis in man and animals. Int J Parasitol，1995，25(2):139195.
15、3 Mac Kenzie WR,Hoxie NJ,Proctor ME,et al.A massive outbreak in Milwaukee of Cryptospori dium infection transmitted through the public water supplyJ.N Engl J 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询Med ,1994,331(3):161167. 4 Watts AM,Kennedy RC.DNA vaccination strategies against infectious diseasesJ.Int J Parasit
16、ol, 1999,29(8):11491163. 5 Perryman LE,Jasmer DP,Riggs MW,et al.A cloned gene of Cryptosporidium parvum encodes neutralizationsensitive epitopesJ.Mol Biochem Parasitol, 1996,80(2):137147. 6 Priest JW, Kwon JP, Moss DM,et al.Detection by enzyme immunoassay of serum immunoglobulin Gantibodies that recognize specific Cryptosporidium parvum antigensJ.Clin Microbiol, 1999,37(5): 13851392.
