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1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询微囊藻毒素 LR 促肝癌过程 p53、p16 基因 mRNA 表达作者：胡志坚, 陈华, 庞春艳, 郑玲, 林奇英 【关键词】 藻毒素类;,摘要:目的 探讨微囊藻毒素 LR(MCLR)促肝癌的分子机制。方法 采用二阶段致癌理论建立中期试验动物模型, 谷氨酰转肽酶(GT)染色检验 MCLR 的促癌作用,并以 RTPCR 结合图像分析技术精确测定大鼠肝脏 p53 和 p16 基因的表达情况。 结果 (1)MCLR 在促大鼠肝癌过程中能显著增加 GT 阳性率。(2)MCLR 在促大鼠肝癌过程中能显著增加大鼠肝脏 p53 mRNA 表达强度,而对 p
2、16 mRNA 表达强度没有影响。结论 调节 p53 表达可能是 MCLR 促癌过程的重要机制。关键词: 藻毒素类; 谷氨酰转移酶; 毒素类; 基因,p53; 基因,p16; 肝肿瘤ABSTRACT: Objective To explore the molecular mechanism of microcystinLR(MCLR) inducing of liver tumor. Methods 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询Acording two stagemediumterm theory to set up the animal model, and bioc
3、hemistry technique to detect the carcinogenesis of the model.RTPCR technique and image analysis were used to study the mRNA expression of the p53 and p16 in the course of inducing tumor. Results (1)MCLR can enhance the positive reaction of GT. (2)MCLR increased the expression of p53, and have not ef
4、fect on the expression of p16. Conclusion (1)MC can induced liver tumor formation strongly. (2)The high expression of p53 may play an important role in the carcinogenesis of MCLR in liver.KEY WORDS: microcystins; glutamyltransferase; toxins; genes,p53; genes,p16; liver neoplasms当前随着全球环境的不断恶化,水体中有毒的藻
5、类对人类健康的影响也越来越受人们的关注。饮水中以微囊藻毒素(microcystin,MC)为代表的藻类毒素已被公认为引起肝癌的三大主要环境因素之一1。MC 是一种特征性的肝毒素,其中以分布广且肝毒性明显的微囊藻毒素 LR(MCLR)为其主要代表物。已有研究表明,福建同安肝癌高发与存在 MCLR 有关2。许多研究表明，基因表达的改变与肿瘤发生密切相关,为进一步了解 MCLR 在肝肿瘤发生过程中的作用和机制,笔者精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询选择与调节细胞周期密切相关的 p53 和 p16 基因进行研究,通过分析它们在藻类肝毒素促肝癌过程 mRNA 表达的变化,从而进一步明确
6、MCLR 的促癌的机制。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 动物 Wistar 大鼠(中科院上海实验动物中心;合格证号:中科动管第005 号)5 周龄,雄性,45 只。1.1.2 试剂 二乙基亚硝氨(DEN,南京土壤研究所),200 mg/kg 腹腔注射。MCLR 纯毒素(美国 Sigma 公司),20 g/kg 腹腔注射。RNA 提取用精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询Trizol mRNA 提取试剂盒(美国 Invitrogen 公司),cDNA 合成用试剂盒(SuperScriptTM FirstStrand Synthesis Systern for RTPCR,美
7、国 Invitrogen 公司)。L 谷氨酰 萘胺、双甘氨肽和固浆紫(上海化学试剂公司)。1.1.3 藻水 在 9 月份藻类繁殖高峰时用 25 号浮游生物网采集福建同安汀溪水库的藻细胞,经镜检 60%为微囊藻。MC 培养基培养,取其培养液作样本,经上海第一医科大学预防医学研究所 ELISA 法检测,该藻水中含 MC 529.656 ng/L。1.2 方法1.2.1 二阶段试验 大鼠随机分成 4 组,正常饲养 1 周后,3 组给予 DEN 200 mg/kg 腹精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询腔注射 1 次,1 组等容量生理盐水腹腔注射(空白对照组)。第 3 周末,4组大鼠均
8、行 2/3 肝切除。第 410 周,DEN+纯毒素组 MCLR 纯毒素 20 g/kg 腹腔注射,DEN 对照组和 DEN+藻水组等容量生理盐水腹腔注射。在此期间,DEN+藻水组饮用藻水,另 3 组饮用自来水。DEN 对照组与 DEN+纯毒素组各 1 只死亡。第 10 周末处死动物,取肝脏做 HE染色、GT 染色和 RTPCR。1.2.2 GT 染色 取 L 谷氨酰 萘胺和双甘氨肽各 20 mg 溶解于 0.1 mol/L(pH 7.2)磷酸缓冲液 16 mL 作为甲液;称取固浆紫 24 mg 溶解于生理盐水24 mL 作为乙液。甲乙两溶液混合过滤制备成染液,将染液倒入染色缸并置于 37 水浴
9、 10 min,将冷冻肝组织切片与水浴中的染液作用3060 min,取出用蒸馏水清洗,然后在 2%CuSO4 浸洗 2 min,蒸馏水再次漂洗。最后苏木精染色,甘油明胶封固。以正常小鼠肾脏作阳性对照,在光镜下观察肝细胞浆,以染成桔红色为阳性。1.2.3 反转录聚合酶反应 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询以组织标本 100 mgTrizolTM 1 mL 的比例将肝癌组织溶于TrizolTM 中,立即于室温研磨混匀,加入氯仿 200 L 剧烈震荡 15 s,室温下静置 23 min,于 4 、7000 r/min 离心 15 min。提取上清即为肝癌组织的总 RNA,经 Su
10、perScript TrizolTMRT 反转录为cDNA。取 cDNA 2 L 于 25 L 反应体系中进行 PCR 反应(引物与条件见表 1)。每个反应包括不加 cDNA 模板的阴性对照。PCR 反应完成后,取 PCR 产物 510 L 进行电泳鉴定,于 1.5%2%琼脂糖凝胶,10 V/cm 凝胶的电压下电泳。凝胶成像系统拍照,ImagePro Plus 图像分析软件对目的基因及内参物电泳条带进行积分光密度(integral opticaldensity,IOD)测定,用目的基因吸光度与 GAPDH 光密度比值代表目的基因的相对表达含量。表 1PCR 扩增引物（略）1.3 统计学处理 利
11、用 SPSS 12.0 统计软件的精确概率法、方差分析、LSD 法对数据分析。上一页 1 2 下一页2.1 肝组织病理形态改变 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询各组肝脏表面光滑,经 2/3 切肝后,残余肝叶均代偿性增大至接近原肝脏体积。纯毒素组肝边缘稍有变纯,质地变硬,体积略小。镜下见:纯毒素组肝脏内出现大小不一的嗜酸、透明、混合肝细胞增生灶,灶内肝细胞混浊肿胀,有水样变性及点状坏死,还可见少量双核、核深染、巨核肝细胞。个别区域间质炎性细胞浸润(图 1);DEN 对照组和DEN+藻水组病灶数明显低于 DEN+纯毒素组;空白对照组未见组织学改变。2.2 MCLR 对肝脏的促癌
12、作用 各组 GT 染色的阳性率有统计学意义(P 0.01)。组间两两比较(精确概率法)结果显示,DEN+纯毒素组 GT 染色的阳性率显著地高于其他组(P 0.05),表明纯毒素对肝癌的发生具有促进作用。DEN+藻水喂养组虽然 GT 阳性率比 DEN 对照组高,但无统计学意义(P 0.05,表2)。表 2 各组 谷氨酰转肽酶染色结果（略）2.3 MCLR 对肝脏 p53、p16 mRNA 表达的影响 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询利用 ANOVA(各组间的方差齐)对各组各指标均数进行检验：(1)p53 mRNA 表达强度各组差别有统计学意义(F=6.532,P 0.01)。
13、利用LSD 法对各组均数之间进行两两比较,DEN+纯毒素组 mRNA 表达强度高于其他 3 组,且有统计学意义(P 0.05),其他各组间差别无统计学意义;(2)p16 mRNA 表达强度的差别无统计学意义(表 3)。表 3 各组p53、p16 mRNA 的表达（略）3 讨论3.1 MCLR 在动物肝癌前病变模型中的作用 按二阶段致癌理论设计的中期动物试验模型是一种评价环境化合物的致癌或促癌作用有效动物模型,这一测试模型是 Ito 等经过长期的摸索后才得以建立3。本次研究中 MCLR 是在 DEN 启动下并经2/3 肝切除激活肝细胞增殖后,进行染毒,其作用阶段为肝癌的促进阶段。显微镜下观察 G
14、T 组织化学检测结果显示(1)HE 染色:纯毒素组肝组织普遍存在有病变程度不同的嗜酸、透明、混合肝细胞增精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询生灶。DEN 对照组、DEN+藻水喂养组虽也可观察到病灶,但数量和大小都比 DEN+纯毒素组少,病变的强度也较轻。空白对照组肝脏未见明显的损伤,说明 MCLR 可增加肝脏的受损程度;(2)GT 是属于转移酶类,在体内的主要的功能是参与“ 谷氨酰循环”,能催化 谷氨酰半胱氨酰甘氨酸三肽中的 肽链水解。GT 与组织的氨基酸和肽的调节、分泌、吸收、转运、合成有关。主要分布于肾、肝、肠、胰等。GT 在正常情况下大鼠的肝脏经 GT 染色成阴性,在胎肝
15、、肝癌发生时表达增强,是目前公认的肝癌癌前病变的指标4。本次实验结果 DEN+纯毒素组 GT 阳性率显著高于其他组,而且在病变灶中染色特别深,说明 MCLR 可显著增加 DEN+纯毒素组 GT 染色阳性率,进一步证实了 MCLR 具有明显的促肝癌作用。同时也证明了本模型建立是成功的。在实验中,DEN+藻水组尚未明显表现出其促癌作用原因可能有两方面,一方面藻水中的毒素含量远低于 DEN+纯毒素组,另一方面其染毒的途径是经口,而文献报道经口的毒性只是腹腔注射的 1/305,故在中期模型中尚不能显示出其明显促癌效应,但也可看出该组GT 阳性率已有增高趋势。3.2 MCLR 的促癌机制 精品文档欢迎来
16、主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询细胞周期的调控失衡是癌变的一个作用机制,其中 G1/S 期的转换是细胞周期中比较敏感的时期,易受内外因素的影响,导致细胞周期的改变,决定继续增殖还是退出细胞周期。因此本课题针对调控细胞周期起决定性作用的 p53 和 p16 mRNA 表达强度进行研究。p53 位于人染色体 17pl3,野生型 p53 通过调节细胞周期或诱导细胞凋亡而发挥其抗肿瘤的作用。但突变型 p53 则丧失上述功能,并且部分突变型 p53 获得促增殖、转化致癌潜能,并能抑制细胞凋亡。正常情况下 p53 蛋白以潜在形式存在并维持低水平。当 DNA 受损时,p53 即被活化表达增强,进一步通过直接或间接影响其下游 p21waf1基因和细胞周期素依赖性激酶(CDK)表达,使细胞周期停滞,以便进行DNA 修复,若修复失败则细胞凋亡6。笔者研究结果显示,DEN+纯毒素组 p53 m
