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1、1急性重症胰腺炎湿热证动物模型建立初探作者：齐文杰,张淑文, 王红,张苗苗,文艳, 王宝恩【摘要 】 目的 通过制作急性重症胰腺炎大鼠模型 ,探索急性热性病湿热证动物模型。方法 采用 5%的牛磺胆酸钠逆行胆胰管注入制作大鼠急性重症胰腺炎模型。观察造模后动物体重、体温、精神、大便、舌苔等,以舌苔厚腻作为评价动物模型湿热证存在的指标。大鼠随机分为模型组、假手术对照组、正常组。造模成功后模型组再根据舌苔是否厚腻分为舌苔厚腻组(A 组)和舌苔正常组(B 组) 。进行血淀粉酶、内毒素、肿瘤坏死因子(TNF)测定及胰腺病理学分析。结果 急性重症胰腺炎大鼠造模后出现倦怠、体重下降(P0.05) 、便溏、舌苔
2、厚腻(出现频率 42.6%)、内毒素及 TNF 水平升高,与假手术组及正常组比较,P0.05, 体温升高不明显。结论 急性重症胰腺炎大鼠模型是一个更符合临床急性热性病湿热证发病过程的动物模型,为湿热证的证型实质探讨提供了较为理想的动物模型。 【关键词】 动物模型;大鼠;湿热证; 胰腺炎Abstract：Objective To explore animal modeling of acute fever disease with damp-heat syndrome by using rat models of severe acute pancreatitis (SAP). Method S
3、AP was 2induced by retrograde injection into the biliopancreatic duct of 5% sodium taurocholate. The body weight, temperature, mental status, stools, fur of tongue, etc. were observed after model made. A white or yellow and greasy tongue coating was considered as a marker to evaluate damp-heat syndr
4、ome of the animal model. Rats were divided into three groups randomly：SAP group, sham operated (SO) group and control (C) group. SAP group was divided further into A group (damp-heat syndrome group which a white or yellow and greasy tongue coating existed) and B group (normal tongue coating). The le
5、vel of serum amylase, endotoxin, TNF and the pathological lesion scores of pancreas tissue were analyzed. Results Lassitude, body weight loss (P0.05), loose stools and a white or yellow and greasy tongue coating (frequency of occurrence is 42.6%) were noted in parts of rat models. The level of plasm
6、a endotoxin and serum TNF were obviously increased (vs the group of SO and C, P0.05). Body temperature of rat models were not significantly changed. Conclusion The SAP rat model can be considered as a good animal model in accordance with acute fever disease with damp-heat syndrome, which supplies a
7、relative ideal animal model for 3exploring the pathogenesis of damp-heat syndrome.Key words：animal model;rats;damp-heat syndrome;pancreatitis湿热证是中医急性热性病中具有特殊规律的一类征候群。临床上许多急性感染性疾病患者在发病过程中表现湿热证候, 予以西医常规抗感染综合治疗效果不理想,病情缠绵难愈,其病机及临床研究已成为近年的热点。借鉴现代医学研究成果,模拟中医热性病湿热证发病机制,建立理想动物模型, 亦是揭示热性病湿热证本质的关键环节。目前, 国内有关湿
8、热证的动物模型多根据中医学关于湿热的成因来模拟建立,采用综合因素造模, 即高温、高湿环境及高脂饮食,加上病原微生物感染。但临床常见急性感染性疾病患者,在起病急骤、病程很短的情况下即可出现舌苔厚腻的“湿”象,并没有高温、高湿的外在因素影响。对于此类急性热性病湿热证证型实质的研究,目前并没有与病情发展相符合的动物模型可供借鉴。急性重症胰腺炎(SAP)患者病情发展过程中常见湿热证,故本研究采用 SAP 来建立一个与临床急性热性病湿热证相符合的动物模型,根据证象(主要是舌苔厚腻)判断湿热证的有无,从而建立湿热证的动物模型。1 材料与方法41.1 动物SPF 级雄性 Sprague Dawley(SD)
9、大鼠,购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心,体重为(20050)g, 动物许可证编号：SCXK-(军)-2007-004。1.2 分组实验前观察大鼠舌苔情况,大鼠正常舌苔为白色,在舌体中部居中处可见。入选大鼠共计 190 只。随机分为模型组(SAP 组)130 只按文中所述方法制作 SAP 模型后, 根据舌苔情况,再分为舌苔厚腻组(A 组)、舌苔正常组 (B 组)、假手术对照组(SO 组)50 只、正常对照组(C 组)10 只。在实验过程中因麻醉意外及病情发展等原因死亡的大鼠相关数据不作统计。1.3 模型制备实验前每只大鼠称体重及测量体温,观察精神、毛色、大便及舌质、舌苔情况,术前禁食
10、 12 h,正常饮水。 SAP 组：采用胆胰管逆行匀速注入 5%牛磺胆酸钠 (0.1 mL/100 g,购自美国 Amresco 公司)方法制作模型1。步骤如下：2% 戊巴比妥钠(50 mg/kg,购自德国Merck 公司)腹腔内注射麻醉 ,沿正中线剑突下逐层切开腹壁进入腹5腔, 于十二指肠内侧见片状分布的胰腺, 找到胆胰管,肝门部胆胰管用无损伤动脉夹夹闭,从胆胰管开口十二指肠系膜缘对侧肠壁穿刺插入4 号静脉穿刺针头,进入肠腔后对准膨大壶腹中心插入胆胰管约 1 cm,微量泵以 0.1 mL/min 速度推注 5%牛磺胆酸钠,观察 24 min 后拔管, 去除动脉夹,缝合十二指肠穿刺口并关腹,
11、术中注意无菌操作。术毕皮下注射 2 mL/100 g 生理盐水 ,以补充丢失水分。大鼠清醒后自由饮水、进食。SO 组：采用 0.9%氯化钠溶液代替 5%牛磺胆酸钠方法制作模型, 具体步骤同上。大鼠清醒后自由饮水、进食。C 组：正常饮水,进食。1.4 检测项目1.4.1 证象观察造模后每只大鼠逐日称体重及测量肛温,观察精神、毛色、大便及舌质、舌苔等证象。1.4.2 血淀粉酶测定 造模后第 1、2、3、5 日,SAP 组、SO组分别取 6 只大鼠,麻醉后心脏采血处死,留取血液-20保存备用,采用麦芽糖苷法测定血浆淀粉酶水平。1.4.3 胰腺组织病理检查6造模后第 1、2、3、5 日,SAP 组、S
12、O 组分别取 6 只大鼠,麻醉后心脏采血处死,留取胰腺组织,4%多聚甲醛固定,常规苏木精-伊红染色行病理检查。胰腺组织经固定后,常规石蜡包埋,4 m 切片。二甲苯脱蜡,经各级乙醇至水洗, 入苏木精染液染色 10 min,自来水冲洗。盐酸乙醇分化约 10 s,至细胞核着色较深, 其他结构无色时为宜。入自来水缓洗约 20 min,使苏木精“蓝化”,胞核呈蓝色。经蒸馏水洗后,入伊红染液染色约 10 min,用蒸馏水洗去多余的伊红。常规脱水,透明, 封片。应注意在苏木精和伊红染色时, 须随时在显微镜下观察是否适当, 如染色过浅, 应重复染色。1.4.4 血浆内毒素测定大鼠血浆内毒素测定采用鲎试剂基质偶
13、氮显色定量法。1.4.5 血清肿瘤坏死因子 测定按照肿瘤坏死因子 (TNF-)定量酶联检测试剂盒说明书进行测定。1.5 统计学方法7用 SPSS11.5 软件包进行统计学分析。所有计量数据采用s表示, 组间比较采用单因素方差分析及 q 检验(Student Newman Keuls Test)。分类计数资料采用 Pearson Chi-square (2 检验)统计方法统计。P0.05)。舌苔厚腻的 A 组体温略有升高趋势。2.1.4 体重变化( 见表 1)2.2 各组大鼠血淀粉酶变化情况(见表 2)表 1 各组大鼠体重变化情况表 2 各组大鼠血淀粉酶水平比较2.3 各组大鼠胰腺形态学及组织病
14、理改变情况C 组大鼠胰腺肉眼所见, 呈均匀淡粉色 ,形态正常,有光泽,腹腔内无腹水,腹腔内器官未见异常改变。SAP 组大鼠注射 5%牛磺胆酸钠后约 10 min,即可见胰腺充血、出血及渗出增多。2 h 后可见皂化斑点形成。造模后 5 d 胰腺失去正常形态,胰腺可见坏死,与周围组织粘连严重,胰腺表面可见皂化斑, 有少量腹水。SO 组大鼠胰腺形态基本正常。造模 5 d 后 SAP 大鼠模型光学显微镜下可见：胰腺实质大片坏死,腺泡及导管失去正常形态, 出血及脂肪坏死增多,大量中性粒9细胞浸润,有钙化形成。2.4 各组大鼠血浆内毒素、血清肿瘤坏死因子 变化情况(见表 3、表 4)表 3 各组大鼠血浆内
15、毒素水平比较表 4 各组大鼠血清 TNF- 水平比较3 讨论本研究结果显示：采用 5%牛磺胆酸钠逆行胆胰管注入制成的 SAP 大鼠模型, 血淀粉酶水平明显升高,胰腺形态及病理改变可见胰腺充血、出血及渗出增多,胰腺失去正常形态,有皂化斑点形成,出血及脂肪坏死增多,大量中性粒细胞浸润。结果支持 SAP 模型的成功建立。在温病模型的探讨中,湿热证模型研究相对较晚。基于中医对于湿热证病因认识的发展,近年认为湿热证的外因湿热毒邪是多重性概念, 既包括自然湿热气候, 又包括病原微生物等在内,故王氏、吴氏等2-3陆续采用增加生物感染因素来制作温病湿热证动物模型。吴氏等3比较 6 种不同的造模方法,认为以饮食因素+气候环境+致病生物因子(感染 )的综合
