《平面和三维培养对兔髓核细胞增殖和基质合成影响的实验研究-2016年最新医学论文》由会员分享，可在线阅读，更多相关《平面和三维培养对兔髓核细胞增殖和基质合成影响的实验研究-2016年最新医学论文（17页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询平面和三维培养对兔髓核细胞增殖和基质合成影响的实验研究作者：朱磊，吴小涛，董寅生，王运涛，邱匀峰，张福勇，鲍军平 【摘要】 目的：探讨兔髓核细胞平面和三维培养对其增殖及基质合成的影响，为椎间盘组织工程寻找一种新的种子细胞获取方法。方法：体外培养兔髓核细胞，分为平面培养组和 PLGA 支架三维培养组两组，利用倒置显微镜、扫描电镜进行髓核细胞形态学观察，MTT法测定各组髓核细胞增殖情况，HE 染色、免疫组化分析髓核细胞型胶原的表达，阿利新兰染色法测定培养液中髓核细胞合成的糖胺聚糖（GAG）含量。结果：经过两周的培养，两组髓核细胞均能够增殖；与平面
2、培养组相比，三维培养组细胞增殖率、型胶原表达量、GAG 合成量均增高（均 P 0.01） 。结论：髓核细胞能够与 PLGA 支架很好地黏附并增殖；PLGA 支架三维培养较平面培养能促进髓核细胞增殖，提高型胶原和 GAG 的合成量，可作为椎间盘组织工程种子细胞获取的一种新方法。 【关键词】 椎间盘退变； 髓核细胞； 组织工程； PLGA 支架； 三维培养；兔精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询椎间盘退变性疾病(intervertebral disc degeneration disease，IDDD)是一类具有高发病率及高致残率的骨科疾病。临床常用的保守治疗和手术治疗方法不能从根
3、本上逆转椎间盘细胞的退变，远期效果不佳。椎间盘组织工程学的迅速发展为 IDDD 提供了一种新的生物学治疗方法，其目的是通过逆转椎间盘细胞水平的病理改变，进而修复和重建退变的椎间盘组织。髓核细胞的退变在椎间盘退变中起了关键性作用，因此，如何获得足量的具备正常生理功能的髓核细胞是椎间盘组织工程学要解决的核心问题。国外学者利用组织工程学方法，对髓核细胞的培养进行了大量的研究，但利用组织工程聚乳酸(PLA)/聚羟基乙酸(PGA)复合生物材料 PLGA 支架三维培养髓核细胞，国内外报道尚少。本实验通过探讨兔髓核细胞平面和 PLGA 支架三维培养对其增殖及基质合成的影响，为椎间盘组织工程寻找一种新的种子细
4、胞获取方法。1 材料与方法1.1 实验动物精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询4 周龄新西兰大白兔（东南大学实验动物中心提供）10 只，体重（50030）g，雌雄不拘。1.2 主要仪器、材料和试剂CO2 孵箱（德国 Heraeus 公司） ，倒置相差显微镜（德国 Zeiss公司） ，扫描电镜（日立 H- 7650 型） ，PLGA 支架（东南大学材料科学与工程学院提供） ，胰蛋白酶、型胶原酶（美国 Gibco 公司） ，D- Hank 液（德国 Biochrom 公司） ，胎牛血清（杭州四季青公司） ，DMEM/F12 培养基、抗坏血酸、二甲亚砜(DMSO)、MTT、阿利新兰试
5、剂、多聚赖氨酸（PLL） （美国 Sigma 公司） ，型胶原免疫组化一抗（武汉博士德公司） ，多孔培养板（美国 Corning 公司） 。1.3 实验方法1.3.1 髓核细胞的分离获取和培养 取 4 周龄小乳兔，0.5%戊巴比妥钠 0.1 mgkg-1 肌肉注射处死，无菌条件下将胸腰段脊柱整段精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询取出，尽量剥尽椎间盘前缘所附着的肌肉，以 D- Hank 液（含青霉素 100 万 UL-1 和链霉素 1 gL-1）冲洗 2 遍，尖刀切开椎间盘纤维环，用眼科镊将胶冻状椎间盘髓核完整取出，以 DMEM/F12（含青霉素 10 万 UL-1 和链霉素
6、0.1 gL-1）漂洗 3 遍后，吸取到0.25%型胶原酶液中，37 消化 15 20 min，期间用吸管轻轻吹打，待组织大部分消化、培养液浑浊后用 200 目不锈钢网过滤，悬液 1 000 rmin-1 离心 8 min，混悬计数细胞，以 1105ml-1浓度接种到培养瓶中，生长培养液为 DMEM/F12（含 15%优质胎牛血清、抗坏血酸 30 gml-1、青霉素 10 万 UL-1、链霉素 0.1 gL-1，pH 7.0） ，置于 37 、饱和湿度、5%CO2 孵箱中培养。每天倒置显微镜观察细胞生长情况，2 d 换液 1 次。另取部分原代培养的细胞爬片行型胶原免疫组化染色鉴定。1.3.2
7、PLGA 支架材料的预处理和实验分组 先将已经制备好的PLGA 支架材料用无菌手术刀片切割成周径 10 mm、高 3 mm 的圆柱体，以 75%酒精浸泡 30 min，磷酸盐缓冲液（PBS）反复冲洗后，培养箱内晾干，滴加适量（2.5 gml-1）多聚赖氨酸（poly-l-lysine，PLL）浸没支架材料，静置 4 h，吸掉多余液体，完成包被，备用。精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询将接近 90%融合的原代髓核细胞弃去培养液，加入少量 0.25%胰蛋白酶消化细胞，倒置显微镜下观察，见细胞回缩、间隙增大时吸去消化液，加入适量含血清的培养液终止反应，用吸管轻轻吹打瓶壁细胞，使之脱
8、落形成细胞悬液。1 000 rmin-1 离心 5 min，弃上清，培养液漂洗 2 次后，用生长培养液 DMEM/F12 混悬细胞，计数制成 1106 ml-1 细胞悬液。将制成的髓核细胞悬液分为平面培养组和 PLGA 支架三维培养组两组培养。1.3.3 髓核细胞的形态学观察 平面培养组：取 2 ml 细胞悬液直接接种于 6 孔培养板中，共 6 孔，置于 37 、 饱和湿度、5%CO2 孵箱中培养，2 d 换液 1 次，每日倒置显微镜观察并定期摄像。PLGA 支架三维培养组：取包被后的 PLGA 支架 8 块，无菌条件下放置到两块 6 孔培养板中，每块支架材料内先滴加细胞悬液 1 ml，培养
9、1 h 后翻转，再在另一面滴加 1 ml 细胞悬液，置于 37 、饱和湿度、5%CO2 孵箱中培养，2 d 换液 1 次，每日倒置显微镜观察并定期摄像。任选 2 块细胞支架复合物标本，在培养 1 周后弃掉培养液，PBS 漂洗 2 遍后加适量 4 预冷 3%戊二醛，4 固定 2 h，PBS 浸洗，10 min2 次，梯度酒精脱水 15 min2 次。标本经乙腈置换、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询真空干燥、真空导电处理后进行扫描电镜观察摄像。1.3.4 MTT 法检测两组细胞增殖情况 取 24 孔培养板两块，一板每孔直接接种浓度为 1106 ml-1 的细胞悬液 1 ml，共
10、 24 孔，作为平面培养组；另一板每孔放入包被后的 PLGA 支架 1 块，将浓度为1106 ml-1 的细胞悬液 1 ml 接种到材料上，共 24 孔，作为 PLGA支架三维培养组。两组均为 24 孔，置于 37 、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养，2 d 换液 1 次，培养两周，于接种后第 2、5、9、14天各组分别取 6 个复孔，每孔加入 MTT（5 mgml-1）100 l，37 继续孵育 4 h，弃上清液，每孔加入 DMSO 1 ml，振荡 10 min 后，吸取各孔液体 150 l 于 96 孔培养板，酶标仪于 490 nm 波长下检测各孔光密度值（OD 值） 。1.3.5 HE 染
11、色、免疫组化分析两组髓核细胞型胶原的表达 同1.3.3 方法，将髓核细胞分为两组接种培养：两组各 6 孔，置于 37 、饱和湿度、5%CO2 孵箱中，2 d 换液 1 次，两组细胞各培养两周。由于前面实验已经证实原代平面培养的细胞爬片型胶原免疫组化染色呈阳性，主要着色部位是胞浆，细胞基质不表达型胶原，故将其中平面培养组髓核细胞在第 10 天时弃去培养液，加入少量0.25%胰蛋白酶消化细胞，倒置显微镜下观察，见细胞回缩、间隙增精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询大时吸去消化液，加入适量含血清的培养液终止反应，用吸管轻轻吹打瓶壁细胞，使之脱落形成细胞悬液。1 000 rmin-1
12、离心 5 min，弃上清，培养液漂洗 2 次后，用生长培养液 DMEM/F12 混悬细胞，制成细胞悬液，接种于 PLGA 支架，继续培养至第 14 天，以利于型胶原从胞浆分泌到细胞外基质，便于与 PLGA 支架三维培养组标本统一切片分析。于第 14 天取出两组支架材料每组 6 块共 12 块，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片、HE 染色。免疫组化（SP 法）检测两组髓核细胞型胶原的表达，一抗为鼠抗兔抗型胶原的单克隆抗体（150） ，二抗为生物素化鼠抗鼠 IgG 多克隆抗体（1500） ，DAB 显色。免疫组化结果判断：型胶原阳性细胞间质呈棕褐色。应用 LeicaQ 550IW 计算机图像分析系统
13、及其软件（LeicaQwinPro.2.2）定量评价呈阳性免疫组化染色的髓核细胞间质的灰度值（灰度分级 0255 级，0 级为最深，255 级为最浅） ，两组每块支架分别取 3 张切片，每张切片随机采集 3 个高倍视野进行测定（200， 向同一个方向移动切片，不重叠，不重复） ，测得结果取平均值，作为每张切片视野内棕褐色的平均灰度值，再取每块支架的 3 张切片的灰度平均值，作为每块支架髓核细胞型胶原表达的间接数值。1.3.6 阿利新兰染色法测定培养液中髓核细胞合成的糖胺聚糖（GAG）含量 收集 1.3.3 中（两组各 6 孔）每次更换的培养液，-20 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来
14、我主页查询冰箱保存，备检。两组细胞各培养两周，将两组细胞培养时所收集的培养液和等体积的新鲜培养液（作为空白液）分别加入 1.5 倍体积的异丙醇沉淀蛋白，使用阿利新兰染色法，以 6-硫酸软骨素（6- CS）溶液为标准品，计算所收集的两组细胞培养液中 GAG 含量。1.4 统计学处理所得数据用 x-s 表示，输入 SPSS 11.5 统计学软件进行统计学处理，组间比较采用 t 检验。2 结 果2.1 髓核细胞形态学观察结果倒置显微镜下可见原代单层培养的髓核细胞 48 h 后开始贴壁，细胞为多角形或梭形，呈岛状生长，胞浆内含有少量空泡，贴壁后精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询伸出伪
15、足。原代培养的细胞爬片行型胶原免疫组化染色呈阳性，主要着色部位是胞浆，细胞基质和细胞核不着色。原代髓核细胞大约 15 d 左右达到 90融合。传至第 1 代后分为平面和 PLGA 支架三维培养，平面培养的髓核细胞保持原代多角形或梭形的细胞形态（图 1A） ，PLGA 支架三维培养组倒置显微镜下显示髓核细胞转为圆形或类圆形，48 h 后开始黏附在支架边缘，随着时间的推移，细胞和支架表面结合更加紧密，由原位向周围增殖、爬行，并逐渐向支架网孔中长入，细胞间接触增多，支架孔隙结构存在，支架暴露面逐渐减小。培养 1 周后进行扫描电镜观察，可见 PLGA 支架呈网状结构，在支架的网状孔眼中可见圆形或类圆形
16、髓核细胞黏附，呈单个或者多个细胞簇样生长（图 1B） 。2.2 MTT 法检测两组细胞增殖结果如表 1 所示，各组 OD 值随培养时间的延长而增大，间接反映了各组细胞数随时间的增加而增加。培养各时段，除分组培养后的第2 天差异无统计学意义外，PLGA 支架三维培养组在第 5、9、14 天均高于平面培养组，差异有非常显著的统计学意义（P0.01） 。表 1 两组髓核细胞增殖结果（OD 值）比较 PLGA 支架三维培养组 6 0.293 60.002 6 0.424 60.003 21） 0.585 80.004 41） 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询0.763 20.006 51） 1）与平面培养组比较，P0.01上一页 1 2 下一页2.3 HE 染色、免疫组化分析两组细胞型胶原表达结果两组细胞支架复合物切片 HE 染色，可见两组髓核细胞呈圆形或类
