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1、1复方田七益智颗粒提取工艺及质量标准研究【摘要】 目的 优选复方田七益智颗粒的最佳提取工艺,并建立其质量标准。方法 以总皂苷的得率为指标, 运用正交试验优选复方田七益智颗粒最佳提取工艺。用 TLC 法对制剂中三七、人参进行定性鉴别, 用分光光度法测定制剂中总皂苷含量。结果 最佳提取工艺为：微波提取 3 次,加水量为 10 倍,每次 30 min。TLC 法供试品与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点,阴性无干扰。人参皂苷 Re 在40200 g 范围内线性关系良好 ,Y250.83X0.017, r0.997 2,精密度和回收率符合要求。结论 本试验确定的提取工艺及质量标准在实际生产中可行。
2、【关键词】 复方田七益智颗粒；正交试验；提取工艺；质量标准；薄层色谱；高效液相色谱法Abstract：Objective To investigate the best conditions of extraction techniques for compound Tianqi Yizhi granule and to establish its quality standards. Methods The best conditions of extraction techniques for compound Tianqi Yizhi granule were optimized by
3、orthogonal experiments, with the yield of total saponins as the index. The qualitative analysis of Panax Notoginseng and Ginseng with Thin-Layer 2Chromatography and determination of total saponins with UV-spectrophotometry was made. Results The optimal condition of total saponins was that the microw
4、ave extraction for 3 times and extracting for 30 minutes, the material-water rate of 110. In TLC procedure, the control material and the test sample showed the same colored spots, while the negative control sample showed no interference. Ginsenoside Re showed a good linear relationship at the range
5、of 40200 g, Y250.83X0.017, r0.997 2. The accuracy and precision were accord to the standards. Conclusion The extraction techniques and the quality standards are feasible.Key words：compound Tianqi Yizhi granule； orthogonal experiment；extraction techniques；quality standards；TLC ；HPLC复方田七益智颗粒是我们在总结前贤治疗
6、血管性痴呆的基础上,结合多年临床经验与现代药理研究成果而创制的。为使该方形成疗效可靠的颗粒制剂,我们采用 L9(34)正交设计安排实验,以该方主要功效成分总皂苷的含量为考察指标,对其提取工艺进行研究,以期优选出可行的提取方法,并建立有效的质量控制标准。31 仪器与试药UV Agilent 8453 紫外分光光度仪 (安捷伦中国有限公司) ；EL204 十万分之一克电子天平( 梅特勒- 托利多仪器上海有限公司)；玻璃层析柱(8 mm90 mm)；D101 型大孔吸附树脂(天津骨胶厂,4060 目)；TLC 常规预制板(10 cm10 cm,江苏汉邦科技有限公司)。人参皂苷 Rb1(批号 0710
7、02)、人参皂苷 Re(批号 070901)、人参皂苷 Rg1(批号 071002)、三七皂苷 R1(070501)对照品均购于中国药品生物制品检定所；药材(市售并经广西中医学院生药学教研室韦松基教授鉴定均为正品)；甲醇、乙醇、高氯酸、香草醛、冰醋酸等试剂均为分析纯。2 方法2.1 提取方法处方中( 三七、人参) 总皂苷可溶于水和乙醇 ,设计了以下 3 种提取方法。2.1.1 水煎醇沉法 4按处方配比三七、人参共 27 g,将三七、人参粉碎成粗粉(2040 目),混合加水煎煮, 具体按正交试验安排进行。将煎好的药液合并、浓缩,加 2 倍体积 95%乙醇沉淀过夜 ,减压回收乙醇,浓缩定容至 10
8、0 mL 备用。2.1.2 微波辅助水煎醇沉法除加热工具为家用微波炉 40%火力外,其他具体方法同上。2.1.3 60%乙醇回流法按处方配比取三七、人参共 27 g,将三七、人参粉碎成粗粉(2040 目),混合加 60%乙醇水浴加热回流,具体按正交试验安排进行。将煎好的药液合并、过滤、减压回收乙醇,浓缩定容至 100 mL备用。2.2 总皂苷含量测定方法2.2.1 吸附树脂的制作将大孔树脂用 95%乙醇浸泡 2 d,加热回流 12 h,抽滤, 用水漂5洗除去杂质,洗至滤液与水(12)混合不产生混浊,水浸泡备用。用滴管吸取浸泡膨胀的树脂,加入盛水的层析柱内,打开活塞,保持水向下流动, 至装入树脂
9、达 6 cm 高,覆以脱脂棉少许,压紧,用蒸馏水冲洗后备用1。2.2.2 对照品溶液的制备精密称取 120 干燥至恒重的人参皂苷 Re 标准品 20.0 mg,用甲醇溶解并定容至 10 mL,即每 1 mL 含人参皂苷 Re 2.0 mg。2.2.3 样品柱层析精密量取 1 mL 供试品溶液,倾入 D101 大孔吸附树脂柱中(带活塞的 8 mm90 mm 柱内装 D101 大孔吸附树脂约 5 g),加热水30 mL,以 1 mL/min 的流速过柱,用 70%冷乙醇 25 mL 以 0.5 mL/min 流速淋洗色层柱,弃去开头 2 mL 流出液,然后收集洗脱液,置 60 水浴上蒸干, 用甲醇
10、溶解残渣,定容至 5.0 mL 供检。2.2.4 标准曲线的制备分别吸取人参皂苷 Re 标准溶液(2.0 mg/mL) 0、20 、40、60、80、100 L(相当于人参皂苷 Re 0、40 、80、120、160、200 g)于 10 mL 比色管中,用氮气吹干,6准确加入 0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液, 再加 0.8 mL 高氯酸, 塞紧盖子, 于 60 以下水浴上加温 15 min 取出,冷却后准确加入冰乙酸 5.0 mL,摇匀后以 1.0 cm 比色皿、560 nm 处测定吸光度,绘制标准曲线,回归方程为：Y250.83X0.017,r0.997 2。2.2.5 供试品含量测定
11、精密量取“2.2.3”项下各提取液 100 L,置 10 mL 具塞试管中, 于水浴中挥干溶剂, 照标准曲线制备项下方法“自加入新配制的 5%香草醛冰醋酸溶液 0.2 mL”起,依法测定吸光度,代入回归方程计算,即得提取液中总皂苷含量。2.3 正交试验设计在对溶媒和提取方法初步选择后,提取方法(A)、溶剂用量(B) 、提取次数(C)作为考察的 3 个因素,每个因素各取 3 个水平，采用 L9(34)正交表进行试验(见表 1),以提取总皂苷的得率为考察指标。提取时间因提取方法不同有所差异2-3。水煎煮：90 min/次；微波水提：30 min/次；乙醇回流提取：90 min/次。表 1 正交试验
12、因素水平表(略 )3 正交试验结果73.1 结果分析(见表 2)表 2 正交试验结果分析表(略)表 2 极差结果说明, 各因素对提取效果的影响程度依次为ACB。其中影响最大的是提取方法 A,其次为提取次数 C,溶剂用量 B 影响很小。因此, 各因素的最佳水平组合为 A2C3B2。对数据进行方差分析,结果见表 3。可知提取方法与提取次数对指标有显著影响, 而溶剂用量对指标无显著影响, 与直观分析结果一致,最佳提取方案为：A2C3B2,即微波提取 3 次,水用量为 10 倍量。3.2 验证试验在以上试验基础上,放大投药量 50 倍, 即 1 350 g,按照相同方法重复试验 3 次,与上述结果相平
13、行,说明优选结果可信。表 3 方差分析表(略)4 质量标准4.1 供试品的制备8按制剂处方称取药材,混合后加 10 倍量水,微波加热提取 3 次,每次 0.5 h(第 1 次浸泡 1 h),浓缩煎液至适量,加 2 倍体积 95%乙醇沉淀过夜,过滤 ,浓缩至相对密度约为 1.21.3 备用,加糊精、甜味剂适量, 混合湿法(14 目) 钢筛制粒,干燥、整粒、灭菌、封装、帖签、入库,即得供试品。连续生产 3 个批次(批号20080506、20080509、20080512)。4.2 定性鉴别取本品 3 g,加氯仿 30 mL,加热回流 1 h,弃去氯仿液, 药渣挥干溶剂, 加水 0.5 mL 使湿润
14、 ,加水饱和的正丁醇 20 mL,超声处理 30 min,吸取上清液加 3 倍量氨试液 ,摇匀,放置分层,取上清液蒸干,残渣加甲醇 1 mL 使溶解,作为供试品溶液。另取人参对照药材各 1.0 g、三七对照药材 0.5 g,同法制成对照药材溶液。再取人参皂苷Rgl、Re、Rbl 及三七皂苷 R1 对照品,分别加甲醇制成每 1 mL 含 2 mg 的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法2005 年版中华人民共和国药典(一部) 附录 B 试验, 吸取上述 7 种溶液各 24 L,分别点于同一硅胶 G 薄层预制板上 ,以正丁醇-醋酸乙酯- 水(425) 放置后的上层溶液为展开剂,预平衡 30 min,
15、展开,取出,晾干,喷以 10%硫酸乙醇溶液,在 105 加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点, 阴性无干扰4 。94.3 含量测定4.3.1 样品供试液的制备取 3 个批号复方田七益智颗粒各 3.0 g,于 60 干燥 5 h,精密称定,置 100 mL 烧杯中,加 40 mL 85%乙醇,超声提取(40 kHz,500 W)30 min,再定容至 50 mL,摇匀 ,放置, 吸取上清液 1.0 mL,挥干后以水溶解残渣,进行柱分离。4.3.2 对照品溶液的制备、样品柱层析、标准曲线的绘制同“2.2” 项下方法。4.3
16、.3 稳定性试验取样品供试液,按照样品含量测定方法,每隔 0.5 h 测定 1 次,共测定 6 次,测定结果基本一致,RSD1.37%。4.3.4 加样回收率试验取已知含量的样品 5 份, 分别加入定量的人参皂苷 Re 对照品,10按照样品供试液的制备方法制备回收率试验测定液,依照样品含量测定方法测定,计算结果, 平均回收率为 98.9%,RSD0.84%。见表 4。表 4 总皂苷加样回收率测定结果 (略)4.3.5 样品含量测定精密量取上述过柱并定容(5 mL)的 3 种溶液各 100 L,分别置于 10 mL 具盖的离心管中,照“2.2.4”项下方法操作,按分光光度法测定供试液在 560 nm 处的吸收度,代入回归方程,计算出供试品总皂苷的含量,结果见表 5。表 5 样品中总皂苷的含量测定结果 (略)5 小结与讨论在中药颗粒剂的生产制备过程中,提取工艺对其最终产品有效成分含量影响最大,
