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1、1反相高效液相色谱法检测鲫鱼肌肉中伊维菌素【摘要】 以鲫鱼肌肉为材料，建立了一种简便、准确的反相高效液相色谱法，用于鱼肉中伊维菌素的药物残留检测和药代动力学研究。鲫鱼肌肉中的伊维菌素用乙酸乙酯提取，离心后的上清液于 45 下氮气吹干，残渣用甲醇 水(41，V/V)混合液溶解，正己烷去脂，离心后取下清液，进样 20 L 进行 HPLC 分析。本方法考察了提取剂、柱温和流动相的影响，确定了以乙酸乙酯为提取剂，柱温 25 和甲醇 水(9010，V/V)为流动相的优化条件。方法线性范围为0.0252.50 g/g，相关系数 r=0.9997，检出限为 11 ng/g。批内 RSD 为 1.0%5.8%
2、，日间 RSD 为 1.0%7.7%，相对回收率(99.84.1)%， 绝对回收率为 (95.93.9)%。本方法具有操作简便，结果准确可靠的特点。 【关键词】 伊维菌素，鲫鱼，肌肉组织，残留检测，反相高效液相色谱1 引 言伊维菌素(ivermectin，IVM)为阿维菌素的衍生物，是目前最优秀的广谱抗寄生虫药之一，具有广谱、高效、用量小、安全等优点，对生物体内外寄生虫，特别是线虫和节肢动物均有高效驱杀2作用。1981 年投入市场后，在临床兽医中得到了广泛应用。而其在水产养殖寄生虫病害防治方面的应用也引起了人们的关注。目前，动物体内伊维菌素残留的检测方法主要有 HPLCUV 检测法1和HPLC
3、荧光检测法2,3。但这些方法多为家畜样品的药物残留检测，对鱼体内 IVM 的测定方法研究甚少。Pantelis 等4利用酶联免疫吸附测定法(ELISA 法)测定了 IVM 在海鲷内的含量; Zhang 等5 利用液相色谱串联质谱法测定了鳗鱼体内 IVM 的残留量; 赵思俊等6采用 HPLC 法检测动物肌肉中多种药物残留;沈金灿等7采用HPLCMS 法检测动物肌肉中兽药残留。这些方法各具优缺点，样品前处理过程均较复杂，且耗时。本研究以鲫鱼为实验对象，对肌肉样品的前处理过程进行了优化，采用反相高效液相色谱法分析了鲫鱼肌肉中 IVM 的残留量。研究结果可为鱼体肌肉组织中 IVM 的残留检测及药代动力
4、学研究提供参考。2 实验部分2.1 仪器与试剂SHIMADZU 高效液相色谱仪(HPLC)，配有 SPD20A 紫外检测器;SupRa22K 冷冻离心机;QGC24T 氮气吹干仪;FSH2 匀浆机;SK2200L 超声波仪;H101 漩涡混合器。伊维菌素标准品(Sigma 公司);甲醇(色谱纯，Merck 公司);乙酸乙酯 (色谱纯，3Urchem 公司);正己烷与无水 Na2SO4 均为分析纯(国药公司);水为MilliQ 超纯水。2.2 实验方法2.2.1 色谱条件 VPODS C18 色谱柱(150 mm4.6 mm，5 m)。流动相为甲醇 水(9010， V/V)，流速 1.0 mL/
5、min。柱温为 25 ; 紫外检测波长为 245 nm; 进样量 20 L。2.2.2 标准溶液的配制 准确称取 50 mg 伊维菌素标准品于50 mL 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得 1 g/L的标准储备液。精确量取 1 mL 标准储备液于 100 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得 10 mg/L 的标准 A 溶液。精确量取标准 A 溶液适量，用甲醇稀释成质量浓度分别为 0.025, 0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 和 2.50 mg/L 的系列标准工作液 。2.2.3 样品的处理 称取鲫鱼肌肉组织 (1.00000.0010) g 于10
6、 mL 烧杯中，剪碎后加少许无水 Na2SO4 和 3 mL 乙酸乙酯，以10000 r/min 匀浆 30 s，将匀浆液倒入 10 mL 尖底玻璃离心管 A中，以 3 mL 乙酸乙酯洗涤刀头和小烧杯，将洗涤液全部倒入 A 管，超声提取 10 min，以 5000 r/min 离心 8 min，将上清液倒入另一支 10 mL 尖底玻璃离心管 B 中，A 管残余物再用 5 mL 乙酸乙酯提4取一次，涡旋振荡 30 s，超声，离心后，合并上清液于 B 管中，在45 用氮气将 B 管提取液吹干后，向 B 管中加入 1 mL 甲醇 水(41，V/V)混合液，超声 5 min 使残渣完全溶解，再加入 1
7、 mL正己烷，涡旋振荡 30 s，3000 r/min 离心 3 min，取下清液 1 mL，以 0.22 m 微孔滤膜过滤，取滤液进行 RPHPLC 检测。3 结果与讨论3.1 样品处理方法的选择和色谱分析条件的优化3.1.1 提取剂的选择 自生物样品中提取 IVM 的常用提取剂有乙腈、乙酸乙酯和甲醇。通过标准加入实验，测得 3 种提取剂的平均绝对回收率分别为 90.5%, 95.9%和 83.1%。甲醇提取的回收率最低，且提取物杂质多，对 IVM 峰的干扰很大。乙酸乙酯和乙腈提取 IVM 时，基质背景相对干净，IVM 峰两边基线平稳，分离效果很好。由于乙酸乙酯提取的回收率最高，且比乙腈更易
8、以氮气吹干，因此选用乙酸乙酯为提取剂。3.1.2 去脂过程的处理 本实验用正己烷去脂，但正己烷与甲醇部分互溶，因此，前处理过程中，氮气吹干后的残渣不能直接加甲醇溶解定容。实验发现，甲醇 水(41，V/V)混合液能很好地溶解残渣，且与正己烷不互溶。因此，氮气吹干后的残渣用甲醇 水5(41，V/V)混合液溶解定容。3.1.3 流动相的选择 当流动相中甲醇与水的比例分别为1000, 937, 919 和 9010 时，IVM 的出峰时间分别为 3.5, 8.1, 9.5 和 13.1 min。实验表明，当用甲醇 水(9010，V/V) 为流动相时，IVM 与杂质分离良好，基线平稳，左右无干扰峰。提高
9、流动相中甲醇的比例会使 IVM 出峰时间提前，IVM 还未与杂质完全分离就出峰，将导致 IVM 峰两边的基线不平，因此本实验选用甲醇水(9010，V/V)为流动相。3.1.4 柱温的选择 比较了 20, 25 和 35 时 IVM 的色谱图可见，温度越高，IVM 的保留时间越短。当用甲醇 水(9010，V/V)为流动相时，3 个温度条件下 IVM 的保留时间分别为 14.7, 13.1 和 10.9 min。IVM 的峰形变化不大，柱效值分别为3542, 3797 和 4084。高柱温时峰形略尖，但由于保留时间会较短，受样品中背景基质的影响，有时会出现 IVM 峰两边基线不平的现象。综合考虑保
10、留时间、柱效和分离度，本实验选用柱温为 25 。 图1 IVM 的色谱图3.2 色谱行为图 1 为 IVM 标准工作液、加标肌肉样品及空白肌肉样品的色6谱图。由图 1 可知，在本实验条件下，基线走动平稳，IVM 的保留时间约为 13 min，无干扰峰出现。3.3 标准曲线取质量浓度分别为 0.025，0.05，0.10，0.25，0.50，1.00和 2.50 mg/L 的 IVM 系列标准溶液 20 L，直接进样，进行HPLC 分析，每个浓度平行测定 2 次，在质量浓度为 0.0252.50 mg/L 的范围内，IVM 色谱峰面积与其浓度具良好的线性关系，A1= 39683C1-680.34
11、，相关系数 r=0.9999。准确称取空白鲫鱼肌肉样品(1.00000.0010)g 于 10 mL 烧杯中，剪碎并向小烧杯中分别添加 1 mL 质量浓度为 0.025, 0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 和 2.50 mg/L 的系列标准工作液，避光静置1.5 h，按 2.2.3 项方法，每个浓度平行测定 2 次，在标准加入质量浓度为 0.0252.50 g/g 时，肌肉样品中 IVM 色谱峰面积与其浓度具良好的线性关系，A2= 35538C2+ 274.39，相关系数r=0.9997。3.4 精密度和回收率分别取含 IVM 0.125, 0.50, 2.50 g/g
12、 的 3 种不同质量浓度加标肌肉样品，按 2.2.3 项方法，每隔一天测 1 次，共测 3 次，每7个浓度平行测定 5 次，据此计算批内和日间精密度(RSD)，结果见表 1。肌肉样品批内 RSD 为 1.0%5.8%; 日间 RSD 为 1.0%7.7%。肌肉样品的相对回收率为 96.9%101.9%; 绝对回收率为91.8%103.8%。表 1 鲫鱼肌肉组织中 IVM 的回收率和精密度3.5 方法检出限根据美国 EPA SW846 的规定进行方法检出限(method detection limits，MDL)的研究8，测定 2 组低浓度加标样品(0.05 g/g)，每组设 7 个平行样，进行
13、差异显著性分析，计算标准偏差 S。以公式 MDL=3.143 S 求出方法检出限。取 =0.05，经差异显著性检验可知 F=0.64F(0.05)=4.75，两组数据无显著差异。计算可得 S=0.003452，MDL =0.011，即本方法的检出限为 11ng/g。表 2 RPHPLC 方法检出限的测定结果IVM 在水产养殖中的应用已很广泛，但由于其存在较大的水生态风险，欧洲许多国家并未批准其作为渔药使用，而目前我国尚无这方面的规定。农业部颁布的 NY 50292001 和 NY50442001二则无公害食品质量标准规定：猪肉脂肪中 IVM 的含量不得超过0.02 mg/kg，牛肉脂肪中 IV
14、M 的含量不得超过 0.04 8mg/kg9， 10。尽管 IVM 在鱼肉中的最高残留量尚无规定，鉴于目前 IVM 在水产养殖中的广泛应用及食品安全的重要性，研究出一种适合检测鱼肉内 IVM 含量的方法已十分必需。本实验以鲫鱼为实验对象，对肌肉样品的前处理过程进行了优化，省去 SPE 柱净化环节，然后采用 RPHPLC 紫外检测法对其进行检测。实验方法简便，回收率高，且获得了良好的 IVM 色谱图。本方法的检出限为 11 ng/g，低于商检行业标准的方法检出限(0.015 mg/kg)11。本方法操作简便、快速、准确，适用于 IVM 在鱼体内的药代动力学研究及鱼体内 IVM 的残留检测分析。【
15、参考文献】1 Zhao JianHong(赵剑虹)， Sun ChengJun(孙成均)， Mao LiSha(毛丽莎)， Yin ZongNing(尹宗宁)， Jiang Bo(江 波)， Li YongXin(李永新). Journal of Sichuan University(Medical Science Edition)(四川大学学报 医学版)，2005，36(1): 1301312 Liu YingGui (刘迎贵)， Su Ya(苏 亚)， Han Qi(韩 琪)，Bao QingShan (包青山). Chinese Journal of Veterinary Drug(中国
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