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1、1反相高效液相色谱法同时检测人血浆利多卡因和罗哌卡因作者：陈丽梅，徐旭仲，刘乐，王权光，胡国新【摘要 】 目的:建立人血浆利多卡因和罗哌卡因的高效液相色谱分析方法。方法 ：高效液相色谱仪为 Agilent 1100 系列；血浆碱化后经乙酸乙酯萃取浓缩，以 ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm150 mm，5m，Agilent，USA）为色谱柱；以乙腈0.02 molL-1 KH2PO4（1684，V/V）为流动相，流速为 1.0 mlmin-1；检测波长为 210 nm；内标为布比卡因。结果：利多卡因和罗哌卡因浓度在 0.0510 mgL-1 范围内线性关系良好（r =0
2、.999） ；最低检测限为 0.05 mgL-1；两种药物高、中、低 3 个浓度的平均相对回收率分别为（99.792.94）%和（100.322.95）% ；平均绝对回收率分别为（68.364.63）%和（70.874.88）%；日内精密度变异系数分别为（0.860.43）%和（1.360.77）% ，日间精密度变异系数分别为（2.071.45）%和（1.430.23）%. 结论：本方法快速、简便、灵敏、准确可靠，适用于血浆利多卡因和罗哌卡因的同时测定及其临床药代动力学研究。 【关键词】 利多卡因；罗哌卡因；反相高效液相色谱法；人血浆；药代动力学2Abstract: Objective: To
3、 develop a high performance liquid chromatography method for the simulta-neous determination of Lidocaine and Ropivacaine in human plasma. Methods: High performance liquid chromatography was equipped with Agilent 1100 series. Lidocaine and Ropivacaine were extracted from plasma with acetic ether aft
4、er alkalization. The analytical column was packed with ZORBAX EclipseXDB-C18(4.6 mm150 mm，5m，Agilent，USA). The mobile phase was consisted of acetonitrile-potassium phosphate buffer (0.02) (16:84， V/V) and the flow rate was 1mlmin-1. The UV detection wavelength was 210 nm. The internal standard was B
5、upivacaine. Results: Excellent linear relationship was obtained from the range of 0.05 mgL-1 to 10 mgL-1(r =0.999). The limit determination of Lidocaine and Ropivacaine was 0.05 mgL-1 and the average relative recovery were (99.792.94)% and (100.322.95)%，respectively. The average absolute recovery we
6、re (68.364.63)% and (70.874.88)%，respectively. The intra-day precision RSD were(0.860.42)% and(1.360.77)%，respectively ；the inter-day precision RSD was (2.071.45)% and (1.430.23)%，respectively. Conclusion:The method is 3simple，rapid ，and accurate. It can be used to determine the Lidocaine and Ropiva
7、caine concentration simultaneously in human plasma and for studying of their pharmacokinetics.Key words: lidocane；ropivacaine；high performance liquid chromatography；human plasma；pharmacokinetics利多卡因和罗哌卡因分别为中效和长效酰胺类局麻药，临床上为了达到更短的起效时间和合理的持续时间，往往将这两种局麻药联合用于神经阻滞1-3。已有高效液相色谱法单独检测利多卡因和罗哌卡因的报道，但是腰丛-坐骨神经阻滞中
8、同时测定两药浓度尚未见报道。本实验建立了碱化萃取后进样同时测定人血浆利多卡因和罗哌卡因的高效液相色谱检测方法，具有操作简便、测定速度快等优点，便于推广使用。1 材料和方法1.1 仪器 高效液相色谱仪为 Agilent 1100 系列（Agilent，Germany） ，包括:G1311A 四元泵，G1322A 在线脱气机，G1316A 柱温箱， G1315B 二极管阵列检测器，G1313A 自动进样器，Agilent 化学工作站（Rev A.08.03.847） 。4电子分析天平（AB204-A，梅特勒-托利多上海仪器公司，灵敏度 0.1 mg） ；漩涡混合器（XW-80 ，上海医科大学仪器厂
9、） ；高速离心机（TGL-16G，上海安亭科学仪器厂）1.2 试剂和药品 甲醇（色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司产品，061115101） ，乙腈（色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司产品，070226101） ，乙酸乙酯（色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司产品，060822101） ，氢氧化钠（分析纯，天津市化学试剂三厂，20041216） ，磷酸二氢钾（分析纯，汕头市金砂化工有限公司，20060301） ，磷酸（分析纯，宜兴市第二化学试剂厂，060301） ，三乙胺（分析纯，上海三爱思试剂有限公司，060830 ） ，实验用水均为超纯水。利多卡因化学对照品（含量为 93.5%，中国药
10、品生物制品检定所提供） ，罗哌卡因化学对照品（含量为 99.8%，由阿斯利康制药有限公司提供） ，布比卡因化学对照品（含量为 99.5%，山东华鲁制药有限公司提供） 。1.3 溶液的配制1.3.1 利多卡因和罗哌卡因标准品溶液的配制：用灵敏度为 0.1 mg 的电子分析天平准确称取利多卡因标准品 25 mg 于 50 ml 容量5瓶中，用超纯水溶解并定容，得浓度为 0.5 gL-1 的利多卡因标准储备液。然后稀释成 50，5，0.5 mgL-1 的标准应用液。以同样方法配制罗哌卡因标准储备液及标准应用液，贮存于 4 备用。1.3.2 布比卡因标准品溶液的配制：布比卡因标准品于干燥器干燥至恒重。
11、用灵敏度为 0.1 mg 的电子天平准确称取布比卡因标准品 50 mg，用超纯水溶解，于 50 ml 容量瓶内定容，最终浓度为0.5 gL-1 布比卡因标准储备液。然后稀释成浓度为 50 mgL-1 的标准（内标）应用液，贮存于 4 备用。1.3.3 0.02 molL-1 KH2PO4 溶液：准确称取 KH2PO42H2O 2.7218 g，加入三乙胺 1 ml，用磷酸调节 pH=4.0，用超纯水溶解后于 1 000 ml 容量瓶内定容。1.3.4 5 molL-1 NaOH 溶液：准确称取 NaOH 10 g，用超纯水溶解后于 50 ml 容量瓶内定容。1.4 色谱条件 色谱柱：ZORBA
12、X Eclipse XDB-C18（4.6 mm150 mm，5m，Agilent，USA） ，流动相：乙腈:0.02 molL-1 KH2PO4=16:84（V/V） ，pH=4.0，流速：1 mlmin-1，检测波长为 210 nm，参比波长 380 nm，柱温：35 4。61.5 血浆样品的处理 准确吸取待测血浆样品 1.0 ml 于 10 ml 具塞试管中，加入 50 mgL-1 布比卡因内标工作液 30l，混匀后加入5 molL-1 NaOH 溶液 40L。再加入乙酸乙酯 4.0 ml，漩涡混匀1 min 后 2 500 rmin-1 离心 10 min。转移上层有机相于另一刻度离心
13、管中，37 水浴条件下氮气流吹干。用 150l 流动相复溶，取上清液 100l 于自动进样器的样品瓶中，设定 20.0l 进样检测。2 实验结果2.1 HPLC 图谱 利多卡因和罗哌卡因纯标准品、空白血浆、利多卡因和罗哌卡因血浆标准以及病人血浆样品，经 HPLC 分析测定得到的色谱图见图 1。由图可见在本实验条件下，利多卡因和罗哌卡因的色谱峰能完全分离，没有明显的内生杂质峰干扰。利多卡因的保留时间为 4.5 min，罗哌卡因的保留时间为 9.7 min，内标的保留时间为 19.5 min。可见本方法具有较高的专属性。2.2 标准曲线的制备及线性范围 取 8 只 10 ml 具塞试管，依次加入不
14、同浓度不同体积的利多卡因和布比卡因标准工作溶液，再加入空白血浆 1.0 ml，配成浓度相当于0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 ，5.0 ，10.0 mgL-1 的血浆样品，再按“1.5 项”血浆样品处理方法处理后，进行分析得色谱图。以测得的利多卡因峰面积与内标布比卡因峰面积之比（Y）对血浆药物浓7度（C ）进行线性回归，得利多卡因的标准曲线回归方程(n=8): C=0.731Y+0.015（r=0.9995） 。同样的方法得罗哌卡因的标准曲线回归方程(n=8): C=0.928Y+0.052（r=0.9992） ，表明在血药浓度 0.0510gml-1 范围内利多卡因与罗哌卡因
15、均呈良好的线性关系。最低检测浓度为 0.05gml-1。2.3 精密度实验 配制浓度 0.1，0.5，5 mgL-1 的利多卡因和罗哌卡因血浆标准品溶液，平行 5 组。按“1.5 项”处理后于同一日内测定，计算日内精密度；连续 5 d 内测定，计算日间精密度（结果见表 1） 。2.4 回收率实验2.4.1 相对回收率试验：配制浓度 0.1， 0.5，5 mgL-1 的利多卡因和罗哌卡因血浆标准品溶液，平行 5 组。按 “1.5 项”处理后进样测定；依据标准曲线计算各自的浓度，计算相对回收率（结果见表 2） 。2.4.2 绝对回收率试验：分别配制浓度为 0.1，0.5，5 mgL-1的利多卡因和
16、罗哌卡因标准品溶液，取 20l 进样检测、记录各自的峰面积，为纯标的峰面积；再配制浓度 0.1，0.5 ，5 mgL-1 的利多卡因和罗哌卡因血浆标准品溶液，平行 5 组。按 “1.5 项”的血浆样品处理方法处理后测定，记录相应的峰面积为该浓度血浆标准的8峰面积。以血浆标准的峰面积与纯标的峰面积的比值计算绝对回收率（结果见表 2） 。2.5 药物干扰试验 取 10 mgL-1 利多卡因和罗哌卡因 100l，分别加入 10 mgL-1 安定、氯胺酮、芬太尼、咪达唑仑、阿托品、麻黄碱、曲马多、万可松、异丙酚和肝素钠 100l 后，用上述色谱条件检测，利多卡因和罗哌卡因的保留时间无明显改变，且互不影响。3 血药浓度的测定选择肝肾功能正常，实施坐骨 陨窬 柚偷南跋亟谝韵率质醯牟?0 例。在局麻下实施桡动脉置管，采集血样。采用神经刺激器定位行改良骶旁坐骨神
