《六月青含药血清对HepG2.2.15细胞 HBV cccDNA的抑制作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《六月青含药血清对HepG2.2.15细胞 HBV cccDNA的抑制作用（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1六月青含药血清对 HepG2.2.15 细胞HBV cccDNA 的抑制作用作者：黄权芳，林兴，黄仁彬，张士军【摘要 】 目的观察六月青(Liuyueqing，LYQ)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用。方法采用血清药理学方法，在 HBV 的体外细胞培养系统中(2.2.15 细胞) 进行 LYQ 抗 HBV cccDNA 作用观察。结果LYQ 含药血清在 HepG2.2.15 细胞培养中可有效地抑制细胞 HBV cccDNA 的复制，其作用呈明显的量效和时效反应关系。结论 LYQ在体外有明显的抑制乙肝病毒的作用。 【关键词】 六月青; 乙型肝炎病毒; HepG2.2.15 细胞; HBV c
2、ccDNAAbstract：ObjectiveTo study the anti-HBV activity of Liuyueqing (LYQ) in vitro. MethodsThe HBV in vitro cell culture system(HepG2.2.15 cell) was used for examining the anti-HBV activity of LYQ with Serum-pharmacology. ResultsThe serum containing LYQ could decrease the HBV DNA level in HepG2. 2.
3、15 cells, and its inhibitory effects were dose-and time-dependent. ConclusionLYQ can inhibit HBV 2DNA in vitro significantly.Key words：Liuyueqing; HBV ; HepG2.2.15 cell; HBV cccDNA六月青(Liuyueqing，LYQ) 系爵床科 (Acanthaceae)植物肖鸡笼(顶花马兰 )Taraphochlamys affinis (Gr iff) Bremekhu Strobilanthes affinis (Griff)
4、 Y.C.Tang的干燥地上部分1 。本课题组前期研究发现，六月青含药血清对 HepG2.2.15 细胞系HBsAg-HBeAg 有明显抑制作用 2，其总皂苷对 HBV-DNA 的复制有显著的抑制作用3。本实验研究六月青含药血清对HepG2.2.15 细胞 HBV cccDNA 的作用，进一步探讨六月青抗乙肝作用机制。1 材料与仪器1.1 药物六月青(Liuyueqing，LYQ)采于广西灵山，由广西中医学院一附院黄权芳中药师鉴定，其水提物由广西医科大学药理学教研室和广西医学科学实验中心提取。1.2 动物 Wistar 大鼠，雌雄各半，体质量(25010)g，实验动物使用许可证号：SYKG 桂
5、 2003-0005;实验动物生产许可证号：3SCXKG 桂 2003-0003;由广西医科大学实验动物中心提供。1.3 细胞株 HepG2.2.15 细胞株( 北京医科大学第一附属医院病毒研究所)，本室自行传代，定期用 G418 筛选。1.4 试剂阿昔洛韦 (Aciclovir，ACV 湖南迪诺制药有限公司医药工业研究所产品，批号: 20070518);RPMI1640 培养基(美国Gibco 公司，CatNo.21202-016); 胎牛血清(美国 Gibco 公司，Cat No.21607-042);G418(美国 Sigma 公司， Cat No.228527-72); QIAamp
6、DNA Mini Kit 试剂盒(Qiagen 公司，No.127141405);HBV DNA 荧光定量 PCR 试剂盒( 深圳匹基生物工程股份有限公司，批号：20070613);SYBR Green PCR Kit(Qiagen 公司，No.127144035)。1.5 仪器 iCycler FQ 实时荧光定量 PCR 仪(美国 Bio-Rad 公司);CO2 孵箱(美国 ThermoForma 公司，Model311)。2 方法2.1 LYQ 含药血清的制备 3 月龄 Wistar 大鼠 50 只，随机分为 5 组，每组 10 只。空白对照组：等量的生理盐水;阳性对照组：ACV 0.1
7、mgkgd-1;LYQH 组：6.6 gkgd-1;LYQM 组：43.3 gkgd-1;LYQL 组：1.7 gkgd-1。各组动物在同样条件下饲养，均以 2 次/d，早晚各 1 次空腹灌胃，连续给药 7 d。于末次灌胃(灌胃前禁食不禁水 12h)后 2 h，乙醚吸入麻醉，腹主动脉抽血，低速离心分离血清，并将每组动物的血清混合。经 56 30 min 灭活处理，经 0.45 m的微孔滤膜，再经 0.22 m微孔滤膜过滤除菌后，置-20 冰箱保存备用。2.2 引物合成P1：ACCGTGTGCACTTCGCTFC ，P2：AGTAGGACATGAACAAGAGATGATTAGG;另一对引物，其正
8、义引物与反义引物均位于负链缺口下游双链区域，可同时扩增：rcDNA 和cccDNA。P3：GCCTCCAAGCTGTGCCTFG，P4：TCTGCGACGCGGCGATrGAG。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。2.3 细胞的培养取 HepG 2.2.15 细胞 1 瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至 2104cellml-1，加入24 孔细胞培养板，每孔 900 l，置 CO2 孵箱(37，5%CO2) 中培养 24 h 后，分别加入各组含药血清 100 l，每个浓度 3 个复孔。以等量的完全培养液为空白对照。连续培养 72 h 后，分别吸出上清液于 1.5 ml
9、灭菌 Eppendor 管中， -20保存，统一待检。再次加入上述含药血清的培养液继续培养 72 h 后，分别吸出上清液于1.5 ml 灭菌 Eppendorf 管中， -20保存，统一待检。52.4 HBV ccDNA 的提取 取细胞样本，离心去上清液， 用QIAamp DNA Mini Kit 试剂盒抽提 cccDNA ， 按试剂盒说明书操作。cccDNA 产物溶于 50 ml pH8.0 的 TE 溶液。测定提取物吸光度 A260nm 和 A280nm， 根据 A260 和 A280 的比值计算样品的 DNA 纯度。2.5 酶切 cccDNA 取 cccDNA 提取物 10 l，用绿豆核
10、酸酶酶切。37温育 25 min，用 2 l 100mmolL-1 的 EDTA(pH 7.4)灭活绿豆核酸酶。2.6 PCR 扩增4取 5 l样品，加入 PCR 试剂和引物，各反应管放入 FQ-PCR 仪，按以下条件进行扩增：94预变性 1 min，95变性 5 s，60退火、延伸 20 s。共反应 42 个循环。扩增过程及荧光信号检查、数据的储存和分析均由仪器及其自带的软件自动完成。2.7 统计学处理采用 SPSS10.0 统计软件分析数据，组间比较采用方差分析。3 结果与空白对照组比较，LYQ 中、高剂量含药血清作用 72，144 6h 后，HepG2.2.15 细胞上清液中 HBV c
11、ccDNA 的拷贝数明显降低(P0.05 或 P0.01)，提示对 HBV cccDNA 具有显著的抑制作用，并且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。结果见表 1。表 1 YLQ 含药血清对 HepG2.2.15 细胞 HBV cccDNA 的抑制作用4 讨论目前慢性乙型肝炎已成为危害人类健康的主要疾病。分子生物学研究表明，HBV-DNA 的复制机制复杂且独特，其复制周期开始于共价环状闭合 DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)，以其为模板利用宿主细胞的酶转录为前基因组RNA，逆转录为负链 DNA，再
12、合成正链 DNA，双链 DNA 又成熟为 cccDNA，是一个连续的过程。 cccDNA 水平的高低与病情复发密切相关。因此检测 cccDNA 的表达，不仅可作为评价药物疗效的重要指标，对病情的诊断及用药指导也有重要的意义。中药是祖国医学的宝贵财富，其中不乏对乙肝病毒有效的药物。本课题组之前的研究显示，六月青含药血清对 HepG2.2.15 细胞系 HBsAg、HBeAg 有明显抑制作用2，其总皂苷对 HBV-DNA的复制也有显著的抑制作用3，提示六月青体外有较好的抗 HBV作用。本实验结果表明，LYQ 中、高剂量含药血清作用 72，144 h7后，HepG2.2.15 细胞上清液中 HBV
13、cccDNA 的拷贝数明显降低(与空白对照组比较，P0.05 或 P0.01)，提示对 HBV cccDNA 具有明显的抑制作用，并且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。本研究通过体外实验进一步证实了六月青有良好的抗乙肝病毒活性。虽然其确切机制尚待阐明，但我们的研究结果表明，六月青是一有良好研发前景的抗 HBV 药。【参考文献】1 林 兴，黄权芳，李 江，等. 广西民间药六月青的性状与显微鉴定J.中药材， 2005，28(7)：541.2 林 兴，黄权芳，张士军，等. 六月青含药血清对HepG2.2.15 细胞系 HBsAg 与 HBeAg 表达的影响J.时珍国医国药，2009，20(7)：1603.3 林 兴，黄权芳，张士军，等. 六月青总皂苷对HepG2.2.15 细胞 HBV 复制的抑制作用J.时珍国医国药，2009，20(11) ：2728.4 彭忠田，申 璀，谭德明，等.脱氧野尻霉素衍生物抗乙型8肝炎病毒的体外试验研究J.中国药房， 2007，18(1) ：22.
