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1、1偶联 EGFR 单抗 C225 的 Fe3O4/Ag 复合纳米颗粒的抗体活性鉴定及其对鼻咽癌细胞增殖的作用作者：赵迪，孙新臣，马珺，童金龙，徐睿智，张伟，肖韦华【摘要 】 目的：研究多功能纳米材料 Fe3O4/Ag/C225 在体外的稳定性、靶向性及抗肿瘤疗效。方法:检测复合纳米颗粒Fe3O4/Ag 的释药水平 ;通过 MTT 比色法初步检测Fe3O4/Ag/C225 抑制鼻咽癌肿瘤细胞生长的作用;采用 ELISA 法检测复合纳米颗粒 Fe3O4/Ag/C225 上的 C225 的稳定性。结果:复合纳米颗粒 Fe3O4/Ag/C225 释药缓慢;偶联在复合纳米颗粒Fe3O4/Ag/C225
2、上 C225 保持了抗体本身约 82%的活性;复合纳米颗粒对鼻咽癌肿瘤细胞抑制作用明显。结论:Fe3O4/Ag/C225 在体外稳定性好，偶联 C225 的复合纳米颗粒保存了抗体活性，对鼻咽癌肿瘤细胞有抑制作用。Fe3O4/Ag/C225 有望发展成为分子影像调强放疗的多功能示踪剂。 【关键词】 Fe3O4/Ag/C225; 纳米; 鼻咽癌Abstract Objective: To study the stability, targeting and antitumor effect of multifunctional nanoparticles Fe3O4/Ag/C225 in vitr
3、o. Methods: The release ratio of 2Fe3O4/Ag/C225 was tested. Inhibitory effect of Fe3O4/Ag/C225 on nasopharyngeal carcinoma tumor cell growth was detected by MTT assay. The level of preserved antibody activity in the composite nanoparticles coupled C225 was detected by ELISA. Results: Composite nanop
4、articles released slowly. Experiments showed that composite nanoparticles inhibited tumor cells of nasopharyngeal carcinoma obviously.The C225 antibody coupling the composite nanoparticles Fe3O4/Ag was maintained well. Conclusion: The composite nanoparticles shows the activity inhibition of nasophar
5、yngeal carcinoma in vitro.The composite nanoparticles coupled C225 preserves the activity of antibody well. Fe3O4/Ag/C225 is expected to develop into a multitracer of molecular imaging intensity modulated radiation therapy.Key words Fe3O4/Ag/C225; nanoparticles; nasopharyngeal carcinoma放射治疗是恶性肿瘤的主要治
6、疗手段之一，随着放疗设备、影像技术等快速发展，出现了三维调强适形放射治疗(IMRT)1。临床上至今未能有理想经影像介导的 IMRT 的示踪剂，这也是放射生3物学中亟待解决的问题和当前研究的热点之一。本实验研究具有自主知识产权的复合纳米颗粒 Fe3O4/Ag/C225，该复合颗粒 Fe3O4可以在调强适形放射治疗中示踪肿瘤，Ag 在前期工作中发现可以作为放射增敏剂，而 EGFR 单抗 C225 起到靶向肿瘤的作用。本研究主要探讨复合颗粒 Fe3O4/Ag/C225 在体外的稳定性、靶向性及对鼻咽癌细胞抑制作用。1 材料与方法1.1 试剂与仪器二甲基亚砜(DMSO，Sigma 公司)，HEPES、
7、胰酶、噻唑蓝(Amersco 公司)等均为分析纯，DMEM(Gibco Bd 公司，美国)，小牛血清(杭州四季青生物工程公司) ，酶标仪( 美国 BD 公司)，CNE(购自中国科学院上海细胞研究所)。1.2 试验方法1.2.1 体外释药速率 用生理盐水配成 10 gL-1 的混悬液，取 10 ml 装于透析袋中，外面透析介质亦为生理盐水，磁力搅拌器常温搅拌 50 h，每隔 1 h 取液测量释放液中 Ag 含量，绘制累积释药曲线。41.2.2 细胞株和细胞培养 鼻咽癌细胞株 CNE 常规培养于含10%小牛血清的 1640 培养液中，置于 37 、5%CO2 的细胞培养箱中。1.2.3 MTT 比
8、色法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期 CNE细胞，消化吹打成 2.5104 ml-1，在两块 96 孔培养板中每孔接种200 l(每板两组，每组 8 个复孔), 置于 37 、5%CO2 培养箱培养。24 h 细胞贴壁后一块培养板分别加入 1640 培养液(阴性对照组)，100、 200、 400、800gml-1 Fe3O4/Ag/C225， 48h 后加入MTT 20 l， 4 h 后弃去液体，每孔加入 150 l DMSO，置于酶标仪上振荡混匀 10 min 测 OD493 nm 值，细胞增殖抑制率 =(1-实验组 OD 值/对照组 OD 值)。1.2.4 酶联免疫吸附实验(ELISA)
9、法检测 取第 2 代培养的鼻咽癌细胞按 2107 L-1 接种于 96 孔灭菌酶标板中，100 l孔-1，5% CO2、37 培养 24 h。洗涤 4 次后晾干，加入 4 预冷的0.25%戊二醇 缓冲溶液， 4 固定 30 min。每孔加 300 l 1% BSA缓冲溶液， 37 封闭 1 h，洗涤 2 次，吸净残留液体。稀释缓冲液将单克隆抗体和 Fe3O4/Ag/C225 按单克隆抗体量梯度稀释，每孔加入 100 l，每组设 6 个平行孔。缓冲溶液作阴性对照， 37 孵育 1 h。洗涤 2 次，加入 HRP羊抗鼠 Ig (1 2 000 稀释)100 5l孔 -1,37 孵育 1 h。洗涤
10、2 次，加入底物液 100 l孔-1，37 避光反应 1520 min,加终止液 50 l。酶标仪检测 492 nm 波长处 A 值，以 C225 和 Fe3O4/Ag/C225 的吸光值对应抗体浓度列表。1.3 统计学处理 采用 SPSS 11.5 软件处理系统进行统计学分析。数据以s 表示，采用 t 检验及方差分析作组间均数比较，以P0.05 为差异具有统计学意义。2 结 果2.1 复合纳米颗粒结构示意图2.2 体外释药速率的动态测定结果以生理盐水为介质考察 Fe3O4/Ag/C225 复合纳米颗粒中Ag 的体外动态释放，计算其累积释放率，48 h 释药为 15.96%(图2)。2.3 复
11、合纳米颗粒 Fe3O4/Ag/C225 的抗肿瘤作用2.3.1 倒置显微镜下所见 正常的 CNE 细胞呈多边形多角形，6胞质伸展，大小一致，细胞之间相互衔接，排列紧密。细胞数量多，贴壁良好，无细胞破裂及细胞碎片。光镜下复合纳米颗粒处理细胞48 h 后，细胞生长明显受到抑制，细胞数量明显减少，部分细胞已变圆、回缩。当浓度达到 800 gml-1 时体外处理组可见大量细胞变圆、回缩，并从培养瓶壁脱落悬浮于培养基中，说明复合纳米颗粒 Fe3O4/Ag/C225 有明显的抑制鼻咽癌细胞的作用(图 3)。2.3.2 MTT 比色法检测结果 Fe3O4/Ag/C225 能显著抑制鼻咽癌细胞株 CNE 增殖
12、，见表 1。2.4 ELISA 法检测结果ELISA 结果显示，复合纳米颗粒 Fe3O4/Ag/C225 中的C225 的活性保存良好( 表 2、图 4)。3 讨 论放射治疗是恶性肿瘤的主要治疗手段之一，据统计约 70%的肿瘤患者在治疗的不同时期需要进行放射治疗2。IGRT 是一种精确放疗技术，靶区内各点的剂量能按设定的要求进行调整，达到靶区内肿瘤体积的剂量最优化。因此 IGRT 减少了周围正常组织的受照射剂量，是当前放疗领域在三维上考虑肿瘤形状、密度并考虑时间因子的先进技术。但临床上至今未能有理想的示踪剂显示肿瘤的7微浸润病灶，成为该项技术进一步发展的瓶颈。当前广泛研究的示踪剂在分辨力、敏感
13、性、特异性及安全性方面都存在或多或少的缺陷。如放射性核素显像方法可以用来评价移植细胞的活性功能，敏感性极高，但空间分辨率太低，且其安全性还远未得到深入评估。荧光成像技术，其背景干净，敏感性极高，但其只能用于动物实验研究、空间分辨力差、解剖细节对应关系不强、光线探测深度较浅等缺陷，注定了其临床应用价值有限3-7。Fe3O4/Ag / C225 多功能复合纳米颗粒 Fe3O4/Ag/C225是我们课题组前期成功制备的，具有自主知识产权的新型抗肿瘤制剂。超顺磁 Fe3O4 纳米颗粒 8具有在磁共振下成像的特性， C225 既具有抑制肿瘤细胞的效应，同时又具有放射增敏效应。我们课题组前期研究证明纳米
14、Ag 颗粒可以增加放射线对肿瘤细胞杀灭作用，有可能成为肿瘤放射治疗的增敏剂9。应用复合纳米颗粒中的 Fe3O4 做为磁共振下成像的显像剂，可能为体内调强放射治疗提供肿瘤细胞的示踪图像。实验中我们首先证实了这种新型材料具有良好的释控性，稳定性好。MTT 比色法检测结果显示，Fe3O4/Ag/C225 对鼻咽癌细胞株 CNE 增殖具有良好的抑制性。为了验证当 EGFR 单抗链接在 Fe3O4/Ag 上时是否很好地保持了抗体的活性，我们通过 ELISA 法检测了复合颗粒 Fe3O4/Ag/C225 中C225 的活性，结果显示抗体活性保存良好。8通过本研究，在已构建的基于生物纳米磁性材料的示踪、增敏
15、、抗肿瘤多功能平台上，从分子影像学、肿瘤分子靶向治疗的角度探讨复合纳米颗粒 Fe3O4/Ag/C225 在体外蛋白及基因水平上的作用机制、在体内的疗效及可能的作用机制，为分子影像引导的调强放射治疗提供一个无创动态的研究手段。【参考文献】1 TANG G, EARL M A, LUAN S,et al. Comparing radiation treatments using intensitymodulated beams, multiple arcs, and single arcsJ. Int J Radiat Oncol Biol Phys， 2010，76(5):15541562.2
16、DENNIS K E, DUNCAN G. Radiation oncology in undergraduate medical education: a literature reviewJ. Int J Radiat Oncol Biol Phys， 2010,76(3):649655.3 HOFFMAN J M， GAMBHIR S S. Molecular imaging: the vision and opportunity for radiology in the futureJ. Radiology，2007 ， 244(1):3947.4 HAUGER O， FROST E E， VAN H R， et al. MR evaluation of the glomerular homing of magnetically labeled 9mesench
