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1、第 19 卷 第 1 期 大学化学 2004 年 2 月膜分子通道揭示了生命现象的化学机制 2003 年诺贝尔化学奖简介李娜 X 杨晓达 XX(北京大学化学与分子工程学院 北京 100871) (北京大学医学部药学院 北京 100085)摘要 2003 年度的诺贝尔化学奖授予洛克菲勒大学的 Roderick MacKinnon博士和约翰斯霍普金斯大学的 Peter Agre 博士 ,以表彰他们在细胞膜水分子通道和离子通道方面所做的开创性工作。本文简介 2003 年诺贝尔化学奖获得者及其工作。2003 年 10 月 8 日 ,瑞典皇家科学院在瑞典首都斯德哥尔摩宣布 ,将 2003 年诺贝尔化学奖
2、授予美国科学家 Peter Agre 和 Roderick MacKinnon ,分别表彰他们发现细胞膜水通道以及对钾离子通道结构和机理研究的开创性贡献。图 1 2003 年诺贝尔化学奖得主1 水通道Agre 博士 1949 年生于美国明尼苏达州小城诺斯菲尔德 ,1974 年在约翰斯霍普金斯大学医学院获医学博士 ,是一位血液病症学家 ,现为约翰斯霍普金斯大学医学院生物化学和医学教授 ,研究妊娠 Rh 抗原的不相容性。对于 Rh 阴性的母亲 ,如果胎儿是 Rh 阳性 ,那么胎儿有可能发生溶血现象而死亡。 Agre 博士和同事在提纯 Rh 蛋白质时 ,发现了一种“污染物”存在于红血球中的另一种蛋白
3、质。如果按照常理 ,用 Agre 博士的话来讲 :“最明智的做法是扔掉这个蛋白质 ,去做更重要的工作”。但是 ,这种“神秘”的膜蛋白质在人类的肾脏和植物中普61XXX 杨晓达 : 北京大学医学部药学院副教授。李娜 : 北京大学化学与分子工程学院副教授。 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.遍存在 ,因而引起了他的兴趣。这种兴趣驱使 Agre 博士进一步开展这方面的科学研究 ,并最终导致了一个伟大的发现。Agre 关于 AQP 蛋白族的意外发现使水通道的研究经历了一场革命 ,并且为生理学和医
4、学的重要领域奠定了坚实的生物化学基础。诺贝尔化学奖评选委员会对此的评价是 :水通道的发现 ,开启了细菌、植物和哺乳动物水通道的生物化学、生理学和遗传学研究之门 ,具有重大的科学意义。人体的 75 %是水 ,可以说水是生命的溶剂。 1920 年代以前 ,人们认为水分子以扩散机理通过细胞膜 ,但水凭借扩散方式通过细胞膜的通量很低以及活化能很高 ,难以解释水分子以很快的速度大量通过细胞膜的现象。该领域的开拓者们提出细胞膜上可能存在调控水分子和其他小的溶质分子进入细胞以及通过膀胱等生物组织的某种分子通道。 1950 年代 ,人们发现水分子可以很快地通过选择性通道进入红细胞 ,而其他溶质分子和离子则不能
5、通过红细胞膜。在以后 30 年的研究表明 ,细胞膜上的水通道是一种具有高度选择性的过滤器 ,在渗透梯度的驱动下 ,允许水分子以约 3 109 分子 / s 的速度通过 ,而质子则不能通过。科学家们一直在寻找水通道蛋白质 ,但是由于水分子是非常简单的分子 ,很难进行修饰 ,所以 ,水通道蛋白质的分离与鉴定是非常困难的。1988 年 ,Agre 从红细胞和肾小管中分离出一种功能未知的新的膜蛋白 CHIP28 (现称为 aquaporin1 或 AQP1) ,分子量 28kDa。 1991 年 ,经过 N2端肽链测序和整个 cDNA 序列测定获得了蛋白的氨基酸序列结构 ,Agre 敏感地意识到 CH
6、IP28 可能就是一直寻求的水通道。不久 ,他证明了这一点。在爪蟾属卵母细胞中表达 CHIP28 使得细胞在低渗介质中很快溶胀。 Agre将纯化的 CHIP28 在脂质体上进行了结构重建 ,观察到了与爪蟾卵母细胞相同的现象。在这两个实验中 ,常用来阻止水通过红细胞膜的 Hg2 +可以抑制细胞溶胀现象。AQP1 的结构很独特。 AQP1 单体含有 6 个跨膜区域 ,N 端和 C端都在胞内 (图 2) 。分子的图 2 AQP1 的“砂漏” ( hourglass)模型 1(a) AQP1 单体有 6 个跨膜区域、 3 个胞外环 (A、 C和 E)和 2 个胞内环 (B 和 D) ;(b) B 和
7、E伸向膜内磷脂层对接构成水通道。两部分具有高度的内在同源性 ,并分别处于 双层磷脂膜的两侧 ,而且同时含有一个三氨基酸基序 Asn2Pro2Ala (NPA) 。所有的水通道都含有这样的三氨基酸基序结构。与 C 端相近的189 位的半胱氨酸对汞化合物很灵敏 ,符合生理学意义上水通道的概念。对环绕任何一个NPA 基序的氨基酸残基进行诱变将减小水的通透性 ,这一现象有力地证明 NPA 与水孔的形成有关。根据以上现象 ,Agre 等提出了“砂漏” (hourglass) 模型 (图 2) 。 B 和 E 两个环伸入双层磷71 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical D
8、isc Co., Ltd. All rights reserved.脂膜 N 和 C两部分折叠构成水孔。晶体学的结果与砂漏模型非常一致。同时晶体学结果还表明 AQP1 以四聚的形式存在于细胞膜中 (图 3) 。图 3 AQP1 的分子模型示意图 (胞外俯视图 ) 2(a) AQP1 单体 ; (b) AQP1 四聚体。水的输送跨膜与氢键的破坏有关 ,HB 和 HE两个螺旋以及相邻的 NPA 上的 Asn 残基对于水的输送过膜起着关键性的作用。由于 AQP1 孔螺旋的偶极距产生的正静电场吸引接近膜中心的水分子的氧 ,使之靠近 NPA 基序。 AQP1 孔在膜中心收紧 ,在膜的两侧表面张开。这样的
9、结构提供了一个高的介电障碍层以排斥离子 ,而同时允许中性溶质通过。图 4 水分子通过细胞膜 AQP1 通道蛋白示意图 2(a) 螺旋的正电荷极性部分约束通过通道的水分子的取向 ,使质子不能通过 ;(b)和 (c)为水分子与通道的 Asn76 和 Asn192 形成的氢键示意图。由于与 NPA 之间的 van der Waals 作用 ,孔螺旋 HB 和 HE 被保留在膜的中间 ;在主链 NH基团和 NPA 基序的 Asn 羧基之间存在的氢键作用结束于短孔螺旋的 N 端。这就导致 Asn76和 192 被定位伸向孔中。水分子中的氧与氨基酸基团形成氢键 ,而代替相互之间形成的氢键。根据分子轨道排布
10、 ,两个氢原子与孔的轴心垂直。在水的单列队中 ,这个水分子无法与相邻的水分子形成氢键 (图 4) ;同时由于孔内是疏水的 ,水分子也无法与孔壁形成氢键 ,此时水分子过膜的能垒最低。而质子无法与大量水形成氢键 ,无法被输送过膜。在细胞水通道的研究中 ,CHIP28 的发现是决定性的。此后 ,研究发现了两组一共至少 10种哺乳动物 AQPs ,这些蛋白质大多与疾病有关。第一组包括 AQP0、 AQP1、 AQP2、 AQP4 和AQP5 ,仅对水有通透性 ;第二组包括 AQP3、 AQP7 和 AQP9 ,除了对水具有通透性 ,也对甘油和其他小分子具有一定通透性。AQP 的生理作用的重要性主要表现
11、在肾脏 ,每天肾脏需要从原尿中再吸收 150 200L 水 ,这81 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.主要是 AQP1 和 AQP2 在起作用。 AQP1 在近端小管中和下垂直管中表达 ,AQP2 在集合管中表达。 AQP2 在细胞膜中的表达受血管加压素控制。 AQP2 水平的升高和降低与肾原性糖尿病以及充血性心衰等体液保持机能病变有关。此外 ,在呼吸系统中发现了 4 种离子通道 ,其分布较为复杂 ,极有可能水通道参与维持肺中水的动态平衡。 AQP1 在脑脊液的生成中也起着一定作用。另
12、外 ,水通道在眼以及其他腺体中都有很重要的生理作用。2 钾离子通道Roderick MacKinnon 博士生于 1956 年 ,在美国波士顿附近的小镇伯灵顿长大 ,1982 年在 Tufts医学院获医学博士 ,现为洛克菲勒大学分子神经生物学和生物物理学教授。 47 岁的 MacKinnon是从一个内科医生转入科学研究的 ,他放弃了许多人不惜一切代价追求的哈佛大学终生教授职位 ,是因为他想解决一个并不容易解决的问题离子通道究竟是怎样工作的 ?离子通道是另一种类型的细胞膜通道 (图 5) ,它催化无机离子沿其电化学梯度通过细胞膜扩散 ,与生物学中的所有电信号传导有关。离子通道控制心跳速度、调控激
13、素分泌进入血液并产生在神经系统中起信号传递作用的电脉冲。人们一直认为离子通道是普通的物理体系。 MacKin2non 在 1998 年测出了钾通道的立体结构 ,震惊了所有的研究团体。诺贝尔化学奖评选委员会的评论是 :由于他的发现 ,人们可以“看见”离子如何通过由不同细胞信号控制开关的通道。图 5 细胞膜及离子通道示意图右图为特定离子通过细胞膜示意图早在 1890 年 ,Wilhelm Ostwald(1909 诺贝尔化学奖获得者 )根据人工细胞膜的实验结果 ,提出了生命组织中的电流是由离子通过细胞膜的运动引起的。 20 世纪初的研究表明膜电位本质上是电化学。 1925 年 ,Michaelis
14、 提出可能存在窄离子通道。 20 世纪 50 年代 ,Hodgkin 和 Hux2ley 研究了离子通过乌贼巨大神经轴突细胞膜的机制 ,此工作引发了神经生理学的研究热潮 ,很快发现了细胞膜上电压控制的钠、钾离子通道和钙离子通道等 ,并据此建立了神经细胞电信号传递理论。快速运输、离子选择性、通道的特异性以及通道失活等概念也随之逐步建立。但是 ,离子通道分子机理仍未阐明 ,人们还不能解释为什么离子通道具有高选择性和高效性。20 世纪 60 70 年代 ,生物化学家对电鳐的一种离子通道蛋白进行了生物化学鉴定。 20世纪 70 年代初 ,科学家应用生物物理技术测定了电压控制的钠、钾离子通道中选择性滤器
15、的尺寸。门和选择性滤器是离子通道中独立的结构单元。通过在爪蟾受精细胞中表达离子通道蛋白质和单通道技术 ,研究了正常和人工诱变的离子通道的性质。科学家很快描绘了各种离子通道的不同功能范围。到 20 世纪 90 年代中期 ,人们弄清离子通道在胞外端有一个窄的选择性滤器 ,在胞内端有一个独立的门。在选择性滤器中 ,氧原子可能处在合适的位置 ,使具有91 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.合适离子半径的离子可以优先去溶剂化 ,进而通过滤器。此后 ,人们发现离子通道蛋白质中形成选择性滤器 P2环结
16、构。但是门控机理和选择性滤器的分子结构的细节还不清楚 ,依赖于高分辨的仪器和方法对离子通道进行结构解析。离子通道是一种膜蛋白 ,膜蛋白的三维结构很难测定 ,而真核生物膜蛋白比原核生物膜蛋白更难操纵。原核生物的离子通道的克隆和高效表达为离子通道的结构阐明提供了一个现实的可能途径。1998 年 ,MacKinnon 的研究获得了突破性进展。他成功地获得了链霉菌 ( KcsA) 钾离子通道的高分辨三维结构 (分辨率为 0. 20nm) 。晶体结构显示 ,钾离子通道由 4 个相同的亚单元构成 (图 6) 。每个亚单元由两个横跨细胞膜的螺旋组成 ,两个螺旋由由一个大约 30 个氨基酸组图 6 KcsA K+ 通道(a) 侧面图 (与细胞膜垂直 ) ; (b) 俯视图 (从胞外 ) 3 图 7 钾离子在通道路径时的电子密度图(摘自 :http :/ / www. hhmi. org/ research/ i
