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1、1不同 pH 值条件下 Cr6+对小球藻和斜生栅藻的毒性效应【摘要】 目的：研究不同 pH 值条件下，重金属 Cr6+对淡水绿藻小球藻和斜生栅藻生长的毒性效应，为我国水质量基准和标准的科学制定提供参考资料。方法：依据 OECD201 藻类生长抑制实验指南，以 72 h 藻生物量为测试终点进行藻类抑制实验。结果：两种藻在不同初始 pH 值条件下的生长潜势不同，小球藻的最适 pH 值为 7.0，而斜生栅藻的最适 pH 值为 9.0。在不同初始 pH 值条件下，Cr6+对小球藻和斜生栅藻的作用均为低浓度(0.5 mgL-1)抑制，且浓度越大抑制率越高。对于小球藻 Cr6+在 pH 值=7.0 时毒性
2、最小，在 pH 值=8.0 时毒性最大;对于斜生栅藻 Cr6+在 pH 值=9.0 时毒性最小，在 pH 值=7.0 时毒性最大。结论：Cr6+在藻的最适 pH 值条件下毒性最小。 【关键词】 Cr6+; 小球藻; 斜生栅藻; pH 值; 水质量基准Abstract Objective： The toxicological effects of hexavalent chromium(Cr6+) on the growth of freshwater green algae, Chlorella vulgaris(C. vulgaris) and Scenedesmus obliquus(S.
3、 obliquus) were investigated at different pH levels in order to provide references to the scientific establishment 2of water quality criteria and standard in China. Methods: According to the OECD guidelines for the testing of chemicals, freshwater alga and cyanobacteria growth inhibition test(OECD20
4、1), taking 72 h biomass as the endpoint, the algal inhibition tests were conducted. Results: The alga grew differently at different initial pH levels, and the optimal growth pH of C. vulgaris was pH=7.0, while the optimal pH=9.0 for S. obliquus. At different initial pH levels, Cr6+ had the stimulati
5、ng effects on both C. vulgaris and S. obliquus when the concentrations were lower than 0.1 mgL-1, and the inhibition effects were observed when the concentrations of Cr6+ were higher than 0.5 mgL-1. The inhibition effects grew stronger with the increasing of the Cr6+ concentrations. For C. vulgaris,
6、 the toxicity of Cr6+ was minimum at pH=7.0, and maximum at pH=8.0. For S. obliquus, the toxicity of Cr6+ was minimum at pH=9.0, and maximum at pH=7.0. Conclusion: The toxicity of Cr6+ is minimum at the optimal pH of the algae.Key words hexavalent chromium; Chlorella vulgaris; Scenedesmus obliquus;
7、pH levels; water quality criteria3我国水生态基准的制定研究零星、分散，当前我国地表水环境质量标准1的标准值主要是参考美国各州、日本、前苏联、欧洲等国家及地区的水质基准值和标准值来确定，没有考虑我国水生态系统的区域性特征。水生态体系的区域性特征如水文条件、气候等多种因素都会影响污染物在水环境中的物理、化学和生物过程，因而可能导致不同的生态效应，这就要考虑到水生态系统的差异性对水生态基准的影响2。因此，在制定水生态基准时，开展环境因子对污染物毒性影响的研究十分必要。铬(Cr)被广泛用于皮革制造业、纺织业、电气行业等，是水体中主要的重金属污染物之一。Cr 的毒性与其
8、存在的状态有极大的关系，自然水体中 Cr 主要以 Cr3+和 Cr6+的形式存在，Cr6+的毒性较强，约为 Cr3+的 100 倍，且具有强致癌、致畸、致突变作用3-4。有调查显示，在我国的十大流域都不同程度地存在着 Cr6+的污染5。在水生系统及水生食物链中，藻类作为水生动物的食物及氧气来源占有重要位置。重金属通过各种途径进入水体后，首当其冲的受害者就是藻类生物，且藻类相对细菌或水生动物而言，对毒物更敏感6-7。目前已有很多关于重金属对藻类影响的研究6，小球藻(Chlorella vulgaris)和斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)是典型的绿藻代表藻种，广泛存在于我国的水
9、体中，对二者的研究已有很多报道8-10 。4OECD(Organization for Economic Cooperation and Development，经济合作与发展组织)提出的淡水藻生长抑制实验规范(OECD201)11 被广泛应用到污染物对藻类的毒性实验研究当中，它已成为被国际公认的进行重金属对藻类毒性风险评价的实验规范之一12 。本实验按照 OECD 提出的淡水藻生长抑制实验规范，选取 72 h 藻生物量为指标，研究不同 pH 值条件下重金属Cr6+对小球藻和斜生栅藻的毒性效应，旨在为研究重金属对水生生物及水生态系统的毒害作用以及我国水体质量基准和标准的制定提供科学依据。1 材
10、料与方法1.1 材料供试小球藻和斜生栅藻藻种均购自中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库。采用 BG11 培养基培养13。由于 EDTA 会与重金属形成螯合物，影响重金属的毒性14，所以去掉培养液中EDTA 成分15 ，培养液初始 pH 值为 8.0。将适量处于对数生长期的藻接入装有 100 ml 培养液的 250 ml 三角瓶，在温度(252)、光照 4 0006 000 Lux、光暗比为 12 h 12 h 的光照培养箱内培养。每天人工摇瓶 3 4 次，随机更换瓶的位置，使其受光均匀。5供试重铬酸钾(K2Cr2O7) 购自天津市北方天医化学试剂厂，分析纯。1.2 实验方法采用国际通用的“瓶
11、法” ，按照 OECD201 淡水藻生长抑制实验指南11 ，以 72 h 藻生物量为测试终点进行藻类毒性实验。测定藻的光密度值(OD680)，建立藻细胞密度(y)与光密度值(x) 间的线性关系(pH 值=8.0)。回归方程：斜生栅藻， y=2 749.501x+13.246， R2=0.993;小球藻，y=2 923.775x-8.480，R2=0.996。计算比生长率和抑制率。=(lnXj-lnXi)/(tj-ti)(day-1)其中， 表示比生长率，day-1;Xj 表示第 j 天的初始藻细胞数，ml-1，Xi 表示第 i 天的藻细胞数，ml-1;ti 表示某时段初始时间，day;tj 表
12、示某时段结束时间，day。I=(c-t)/c100(%)其中，I 为抑制率; c 为对照组的比生长率，t 为处理组的比生长率11 。6OECD 曾推荐用无观察效应浓度(no observed effect concentrations, NOEC)和 EC05 或 EC10 置信区间的下限来作为安全暴露基准浓度，同时给出最小观察效应值(lowest observed effect concentrations, LOEC)。NOEC 指的是毒性作用与对照组无显著差异的最大处理浓度;LOEC 指与对照组有显著差异的最小浓度;EC05 和 EC10 分别指产生 5%和 10%毒性效应的浓度16-1
13、7。本研究采用 SPSS 13.0 进行数据处理，用单因素方差分析比较显著性差异，采用 Dunnettt 检验进行多重比较以确定 Cr6+对小球藻和斜生栅藻的 NOEC 和 LOEC，并对结果进行回归分析，得出 EC05和 EC18-1910。1.3 实验内容1.3.1 pH 值对藻生长的影响 自然水体的 pH 值范围一般是中性偏碱，本实验设定初始 pH 值为 7.00.2、8.00.2 和9.00.2(以下简写为 pH 值=7.0、8.0 和 9.0)，用 HCl 和 NaOH 调节培养液的 pH 值。接种一定量处于对数生长期的藻，每个 pH 值设 3 个平行，置于人工气候箱中，每隔 24
14、h 测定藻的光密度值。1.3.2 pH 值对 Cr6+毒性的影响 在初始 pH 值为 7.0、8.0和 9.0 的培养液中加入不同体积的 Cr6+贮备液，充分摇匀后接入一7定量处于对数生长期的藻。设置 Cr6+的 10 个处理浓度和 1 个空白，处理组 Cr6+的浓度分别为 0.000 1、0.001、0.01、0.05、0.1 、0.25、0.5、0.75、1.0 和 1.5 mgL-1(离子浓度) ，每个处理组设 3 个平行。放入培养箱中，测定 72 h时藻光密度值(OD680)，并计算 Cr6+对藻生长的抑制率以及毒性效应值 EC05 和 EC10。2 结果与讨论2.1 pH 值对藻生长
15、的影响由图 1 可见，在初始 pH 值=7.0 时，小球藻在 48 h 和 72 h时的生长显著高于 pH 值=8.0 和 9.0 时(P0.01); 斜生栅藻在 pH值=9.0 时在 48 h 和 72 h 时的生长显著高于 pH 值=7.0 时(P0.01)，但与 pH 值=8.0 相比没有达到显著性差异。有资料表明，小球藻的最适 pH 值为 6.07.020，而斜生栅藻的最适 pH值为 9.010.021 ，这与本实验结果一致。* P0.05， * P0.01。以 pH 值=7.0 为基础作统计分析图 1 pH 值对小球藻和斜生栅藻生长的影响8Fig 1 The effects of p
16、H on the growth of Chlorella vulgaris and Scenedesmus obliquus 藻类生长与藻本身的生理特点以及温度、光照、营养盐、其它生物、pH 值等诸多环境因素有关，其中水体 pH 值是一个重要的生态因子，与藻类生长关系密切。不同藻类有一定的 pH 值适应范围，即使同一属的两种藻，在不同 pH值下，其生长也可能有很大差别22。水体 pH 值主要从两方面对藻生长产生影响，一方面改变环境酸碱度，酸性太强(H+浓度高)或碱性太强(OH-浓度高)都会对藻细胞产生伤害，只有在适宜的酸碱度范围内藻细胞才能正常生长繁殖;另一方面是影响碳酸盐平衡系统以及不同形态无机碳分配关系，从而对藻类生长产生影响21。在低 pH 值下大部分的无机碳以 CO2 的形式存在，而在高 pH 值下(pH
