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1、1三氧化二砷协同柔红霉素对 K562/A02 细胞株的作用作者：王珂，丁家华，吴玮玮，陈宝安，顾炎，袁鹏【摘要 】 目的： 研究三氧化二砷(As2O3)及柔红霉素（DNR）联合应用后对人白血病耐药细胞株 K562/A02 的作用，探讨其应用于临床的可能性。方法： 采用 MTT 比色法测定单用 DNR及 DNR 与不同浓度 As2O3 合用时的生长抑制效果，用流式细胞术检测胞内 DNR 浓度及凋亡。结果： DNR 对 K562/A02 细胞的半数抑制浓度（IC50）为 15.4 mg/L，加用 0.25，0.5 ，1.0 mol/L As2O3 时的 IC50 分别为 1.73,0.78，1.4
2、2 mg/L。1 mg/L DNR 作用于 K562/A02 48 h 后的凋亡率为(17.42.19)%，0.5 mol/L As2O3 作用于 K562/A02 48 h 后的凋亡率为(53.85.6)%，而两药合用后凋亡率为(65.56.2)% ，但合用后胞内 DNR 浓度并未增加。结论： 低浓度的 As2O3 与 DNR 联合应用对 K562/A02 细胞的抑制为协同作用，其效应与增加药物的诱导凋亡作用有关，而非通过增加胞内 DNR 浓度。 【关键词】 药物疗法； 联合； 多药耐药； 三氧化二砷； 柔红霉素2Abstract Objective: To explore the cyto
3、toxity of combination of arsenic trioxide and daunorubicin on multidrug resistance of cell line K562/A02, and study the feasibility of combination of two drugs in clinical drug therapy.Methods： MTT assay were used to measure the growth inhibitory effect of DNR with or without various concentration o
4、f As2O3. The intracellular concentration of DNR and apoptotic changes were observed by flow cytometry. Results： The IC50 of DNR on K562/A02 cells was 15.4 mg/L. The IC50 of DNR combined with 0.25，0.5，1.0 mol/L As2O3 on K562/A02 cells were 1.73,0.78,1.42 mg/L respectively. The apoptosis percentage of
5、 treating K562/A02 cells with DNR 1 mg/L，As2O3 0.5 mol/L and both for 48 hours were（17.42.19）%， （53.85.6 ）% and （65.56.2 ）%. But the intracellular concentration of DNR didnt raise after combination of two drugs. Conclusion： As2O3 can present a synergistic effect with DNR on K562/A02 cells.The main m
6、echanism may attribute to induction of apoptosis but not increasing the intracellular DNR content.Key wordsdrug therapy; combination; multidrug resistance; arsenic trioxide; daunorubicin3白血病是常见的血液系统恶性肿瘤，在儿童肿瘤发病中占 50%以上。目前，化疗仍为白血病治疗的有效手段，尽管不断有新的化疗药物和化疗方案推出，但肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药是化疗失败的主要原因，至今仍为肿瘤治疗的一大难题。目前临
7、床用来克服耐药的手段主要有两个：尽量选择患者敏感的药物，加大化疗药物剂量；应用耐药逆转剂联合化疗以克服耐药。前者是应用比较普遍的方法，但疗效不理想，患者往往因出现各种严重的并发症而死亡，因此寻找合适的联合化疗方案受到了越来越多的关注。三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）是一种与巯基（ -SH）有高度亲和力的原浆毒，已成功应用于治疗急性早幼粒细胞白血病, 对其他类型的白血病及多种实体瘤也有效。国内外研究表明，As2O3 对一些耐药细胞株仍有诱导凋亡1-3及逆转耐药4的作用。柔红霉素（daunorubicin，DNR）是一种蒽环类抗肿瘤药，是一种目前广泛运用于血液系统肿瘤和各
8、种实体瘤的化疗药，为细胞周期非特异性药物，对 G2 期作用尤其显著。我们用 MTT 法检测了 As2O3 及 DNR 对白血病多药耐药细胞株 K562/A02 的细胞毒性，并通过流式细胞仪检测了凋亡，进一步探讨了 As2O3 与化疗药物组成联合化疗方案治疗耐药白血病的可能性。1 材料与方法41.1 细胞系及培养敏感株 K562 及其多药耐药（MDR）株 K562/A02 由中国医学科学院血液学研究所提供。两种细胞均接种于含 10%小牛血清的RPMI1640 培养液中，置 37,5% CO饱和湿度培养箱中，23天传代 1 次。K562/A02 细胞维持增殖的多柔比星终浓度为 1 mg/L,实验前
9、无药培养 2 周。1.2 试剂噻唑蓝（MTT ，Sigma 公司） ，RPMI1640 培养液、小牛血清（Gibco 公司） ，柔红霉素（DNR，Farmitalia 公司） ，亚砷酸注射液（As2O3，哈尔滨伊达药业有限公司） 。1.3 MTT 法检测不同浓度 As2O3 及 DNR 合用时的生长抑制作用取对数生长期的 K562 及 K562/A02 细胞以 2105/个细胞悬液160 l，分别加入浓度为 2.5 及 50 mg/L 的 DNR，倍比稀释 8 个浓度，每个浓度梯度的培养体系中加入 As2O3 使其终浓度为0.25，0.5，1.0 mol/L，每个浓度设 3 个平行孔，另设不加
10、细胞、不加 As2O3 及不加 DNR 的对照组，生理盐水调节每孔终体积为5200 l， 。置 37,5% CO饱和湿度培养箱中培养 48 h 后取出，加 5 g/L MTT 反应液 20 l，继续培养 4 h,于平板离心机上 3 000 r/min 离心 10 min，弃上清，每孔加 150 l DMSO 溶解，微量振荡器上混匀，酶标仪上测定 540 nm 的光密度值 D，计算细胞的生长抑制率：生长抑制率=1-实验孔 D 值对照孔 D 值100%IC50 为细胞生长抑制率为 50%时的药物浓度。1.4 流式细胞仪检测凋亡率实验分组如下：A 组为空白对照组，B 组为 DNR 组，C 组为As2
11、O3 组，D 组为 DNR+As2O3 组（其中 DNR 终浓度为 1 mg/L，As2O3 终浓度为 0.5 mol/L） 。孵育 48 h 后收集细胞，用4预冷的 PBS 洗涤 2 次，用 1 ml blot 缓冲液重悬细胞，各加入10 l Annexin VFITC，常温避光 15 min 后洗涤细胞，重悬后检测。检测前仪器需调节补偿。1.5 流式细胞仪检测细胞内 DNR 浓度根据蒽环类药物可自发荧光的特性（488 nm 激发光下发红光）可检测胞内 DNR 浓度。取对数生长期细胞按前述条件分组处理 48 6h 后收获细胞，用冷 PBS 洗涤 2 次，1 ml PBS 重悬后上样。1.6
12、确定药物联合作用的方式根据文献5 ，假定有两种药物的生长抑制率分别为 A 和 B，且 A B。依据最大化模型，两药联合作用时预期的生长抑制率 C应等于 A。若 CA，两药为拮抗作用；若 C1-(1-A)(1-B)，两药为协同作用；若 C 介于这两者之间为相加作用。1.7 统计学处理IC50 采用线性回归法处理，统计数据用s 表示，采用SPSS11.5 统计软件进行 t 检验和方差分析。2 结果2.1 两药合用时的 MTT 结果不同浓度的 DNR 与 As2O3 合用后的细胞生长抑制率与单用DNR 时比较，除 DNR 浓度为 50 mg/L 组外，其余差异均有统计学意义（表 1） ，K562/A
13、02 中加入 0.25，0.5，1.0 mol/L As2O3后其 DNR IC50 值由 15.4 mg/L 变为 1.73，0.78，1.42 mg/L，耐7药逆转倍数达 8.9，19.7 ，10.8（表 2） 。表 1 DNR 联合不同浓度As2O3 对 K562/A02 的生长抑制率（略）表 2 DNR 联合不同浓度As2O3 对 K562/A02 的 IC50 值及耐药逆转倍数（略）根据 MTT 结果选择 DNR 浓度为 1 mg/L，As2O3 浓度为0.5 mol/L 作为下一步实验研究的浓度。单加 0.5 mol/L As2O3后的细胞生长抑制率为（46.82.0）%，单加 1
14、 mg/L DNR 后的细胞生长抑制率为（23.83.8）%，两药合用后的细胞生长抑制率为（71.22.9 ）% ，为协同作用。2.2 Annexin V 检测细胞凋亡单加 DNR 组的凋亡百分比为（17.42.19）%，单加 As2O3 组的凋亡百分比为（53.85.6）%，两药合用后的凋亡百分比为（65.56.2 ）% （图 1） 。2.3 流式细胞仪检测细胞内 DNR 浓度以 K562 加 1 mg/L DNR 后胞内的荧光强度为参照，未与As2O3 合用时 K562/A02 胞内的荧光强度为 K562 的（45.63.2 ）% ，而加 As2O3 后胞内的荧光强度为 K562 细胞的（
15、29.52.1）%，胞内的 DNR 浓度未增加。83 讨论As2O3 已证实对急性早幼粒细胞白血病（APL ）有良好的促凋亡作用，临床应用于 APL 也取得了较为满意的疗效6 。实验室研究表明，As2O3 对其他血液系统肿瘤、实体瘤及多种耐药细胞仍有诱导凋亡的作用，但所需浓度较高7 ，在低浓度时它可诱导肿瘤细胞发生部分分化8 。 As2O3 体内药代动力学表明，0.1% As2O3注射液 10 ml 一次给药后体内浓度 810 h1 mol/L 9 。能否将临床易达到的低浓度 As2O3 与化疗药联合治疗多药耐药白血病，对此我们进行了研究。我们的实验观察了1 mol/L As2O3 与 DNR
16、 合用时对K562/A02 细胞的细胞毒作用，发现两药合用后能明显增强对多药耐药细胞株的细胞毒性，在 0.5 mol/L 时的耐药逆转倍数达19.7，且 As2O3 在较低浓度时即可与 DNR 呈协同效应，随着浓度的升高，其协同效应逐渐减弱。推测其原因可能有：As2O3 并非P糖蛋白的作用底物1 ，在 MDR 时 As2O3 仍可进入胞内发挥作用。降低 GST 的表达，抑制 GST 的活性，与还原型谷胱甘肽(rGSH)的巯基相结合，降低胞内 rGSH 的浓度，从而增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性10 。As2O3 与化疗药作用的细胞周期不同，As2O3 可使细胞周期阻滞于 G1/S 或 G2/M11，12 ，DNR为细胞周期非特异性药物，对各期细胞均有杀伤作用，但对 G2 期9作用更显著。肿瘤的多药耐药是目前化疗失败的原因，其机制主要有膜
