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1、1“肝郁证”方证的代谢组学研究作者：徐舒，陈合兵，李洪，张琪，蔡红兵，颜贤忠，吕志平【摘要 】 目的在肝郁证大鼠模型代谢组学研究基础上，进行逍遥散治疗肝郁证大鼠模型的方证代谢组学研究，探讨逍遥散治疗机制及进一步明确肝郁证的代谢组学特征。方法 24 只 Wistar 大鼠随机分为逍遥散+模型组、逍遥散+空白组、模型组、正常对照组，每组6 只。逍遥散+模型组和模型组采用慢性束缚的方法造模，逍遥散+模型组和逍遥散+空白组同时用逍遥散灌胃，第 22 天采血检测血浆皮质酮，运用 1H NMR 技术对 4 组大鼠血清进行代谢组学分析。结果模型组大鼠第 15 天，22 天体质量增长缓慢，显著低于其它三组(P
2、 均 0.01);4 组血浆皮质酮存在差异(P0.001)，浓度从高到底依次为模型组、逍遥散+模型组、逍遥散+空白组和正常对照组，组间比较模型组显著高于逍遥散+模型组及其它两组(P0.01)。代谢组学分析表明，4 组样本间沿第 1 主成分 (t1)方向有明显的分组差异，其中逍遥散+空白组与正常对照组之间稍有差异，而逍遥散+模型组与正常对照组样本的差别较大，模型组与正常对照组样本的差别最大，且物质的变化大多呈单向改变。结论逍遥散对肝郁证的治疗作用在代谢物水平并非仅仅简单的上调、下调从而中和模型造成的代谢物变化，而可能是通过对机体的整体调节发挥治疗作用。通过方证整体研究，找出随证候模型和相应方剂治
3、疗后变化一致并2趋于正常的物质，可能较好地代表证候的代谢组学特征，从而更适合于中医证候研究。 【关键词】 肝郁证;代谢组学;1H 核磁共振; 大鼠模型;方证研究方证研究是中医证候研究的特色，以证选方，以方测证，方证之间紧密联系，有极强的客观性和科学性。将方证作为一个整体去研究，可以克服一般证候的模糊性和恒动转移性，更能有效地展示证本质。通过观察某一证型在相应方药治疗前后临床症状的改善，不仅证实对原证候辨证的准确性，同时也说明所选方药是对“证”的; 也就是通过“疗效”这个中心环节，同时证明“方”和“证”的科学性，这是由中医学理论理、法、方、药的一致性和整体观决定的; 通过方证的整体研究从正反两个
4、方向挖掘证的科学内涵，其同一性变化更能代表某一证特异性的变化。在成功建立“肝郁证”大鼠模型并对其进行代谢组学的初步研究基础上1，本课题组继而运用代谢组学方法对“肝郁证”的方证进行整体研究，以期进一步揭示肝郁证的科学本质。1 材料与方法1.1 动物与材料实验用清洁级雄性 Wistar 大鼠 24 只，体质量(15020)g，购自南方医科大学实验动物中心。适应性饲养 1d3后随机分为模型组、正常对照组、逍遥散+模型组和逍遥散+空白组共 4 组，每组各 6 只。正常对照组 3 只 1 笼，其余 3 组单笼孤养。恒定温度(213) ，光 -暗周期为 12 h，动物自由摄食及饮水。逍遥散制剂：按太平惠民
5、和剂局方原方比例调配(每剂中含柴胡12 g，当归、白芍、白术、茯苓各 10 g，生姜 6 g，炙甘草 3 g，薄荷 3 g)，药物加 10 倍于药材量的水浸 1 h 后，加热煮沸 1 h，过滤后，再加水煮沸 40 min，于 80恒温水浴中浓缩成含生药量 1 g/ml，存于-4冰箱备用。药材购于南方医院中药房，经中医药学院中药教研室鉴定为正品药材;中药煎液由南方医科大学中医药学院中药制剂教研室制备。1.2 造模和干预参照严灿等2慢性束缚的方法，将模型组和逍遥散+模型组大鼠置于特制的束缚制动筒内，通过移动插片逐步缩小大鼠的活动空间，调节到其不产生强烈反抗的最小空间。每日开始时间随机，束缚制动 1
6、 次/d，持续时间从第 1 天的 4 h 逐渐增至 6 h/d，连续 21 d。模型组和逍遥散+模型组大鼠在束缚制动期间禁食、禁水。逍遥散+模型组和逍遥散+空白组大鼠根据正常成人逍遥散每日用量，按体表面积换算成大鼠用药量为 10 g/(kgd)，根据个体体质量每日上午 8 时给逍遥散+ 模型组和逍遥散+空白组大鼠经胃灌相应药量。1.3 取材造模第 21 天 4 组大鼠均禁食不禁水，造模第 22 天4各组大鼠用 10 %的水合氯醛腹腔注射，打开腹腔由腹主动脉采血约8 ml，抽取的血浆室温下静置 2 h，3 000 r/min 离心共 10 min，取上游血清-40 冰箱保存待检。1.4 行为学观
7、察和血清皮质酮检测造模期间观察大鼠行为、反应、排便、饮食等一般情况的变化，并在第 8，15，22 天称取体质量进行比较。大鼠皮质酮酶联免疫分析试剂盒购自 USCN LIFE(Catalog No.E0540r)，按说明书步骤检测 4 组大鼠血清皮质酮含量。所得数据以s 表示，用统计软件 SPSS13.0 分别进行重复测量方差分析和单因素方差分析，LSD 组间比较，以 = 0.05 为显著性水准。1.5 代谢组学检测分析运用 1H NMR 技术对 4 组大鼠血清进行驰豫编辑实验(CPMG) 和扩散编辑实验(LED)核磁共振实验，分别观测血清中的小分子代谢物和脂类代谢产物。对一定区间内的谱图按每段
8、 0.04 ppm 的宽度进行分段积分，其中 CPMG 数据积分范围为 0.4 4.4;LED 数据积分范围为 0.26。将积分按每张谱的总积分强度归一化。所得积分数据输入到 SIMCA-P+软件(v10.04, Umetrics, Ume, Sweden)进行分析。数据采用 Pareto 标度化(Pareto scaling)进行预处理之后采用主成分分析(PCA)或偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)。分析结果以得分图和载荷图表示。52 结果2.1 一般观察 逍遥散+模型组、模型组大鼠在造模第 1 周表现为易激惹、挣扎，随着造模的继续，第 2、第 3 周模型组表现为躲避、活动减少和对外界刺激
9、反应减少，安静时埋首、拱背，大便松散，皮色失去光泽;而逍遥散+模型组灌服逍遥散后也有活动减少表现，但对外界刺激反应与逍遥散+空白组、正常对照组大鼠无明显区别，大便便质未见明显异常，活泼度好于模型组大鼠。重复测量方差分析显示，随着造模和药物干预的进行，各组间在第 15 天，22 天体质量出现显著性差异(P 值分别为 0.002，0.005) ，其中模型组最低，逍遥散+模型组经药物干预后好于模型组组，逍遥散+空白组和正常对照组体质量增加较好。表明模型造成大鼠体质量增加缓慢，而逍遥散能改善这种情况(见表 1)。表 1 各组大鼠体质量变化比较2.2 血浆皮质酮检测各组大鼠第 22 天血浆皮质酮水平比较
10、有显著性差异，其中模型组、逍遥散+模型组皮质酮水平显著高于未造模处理的逍遥散+空白组和正常对照组，但逍遥散+空白组与正常对照组组之间差异无统计学意义，同样造模的逍遥散+模型组与模型组间也无明显差异(P=0.494)。结果见表 2。表 2 各组大鼠血浆皮质酮浓度比较62.3 代谢组学分析结果笔者此前已就模型组与正常对照组大鼠血清代谢组学进行比较，与正常对照组相比，模型组血浆中 12种物质发生浓度变化，含量升高的 Glucose、Cr，含量下降的有 3-HB，Gln，Glu，Lac ，NAc，OAc，UFA， VLDL/LDL，PCho 和PtdCho1。其中哪些物质更能代表 “肝郁证 ”模型的代
11、谢组学特征，逍遥散治疗肝郁证的机制是什么?为此分别比较逍遥散+模型组与模型组间代谢物差异，了解逍遥散干预后模型大鼠血清代谢组学的变化;同时考虑到逍遥散本身对代谢组学的影响，比较逍遥散+空白组与正常对照组间代谢组学差异;最后将 4 组血清代谢组学同时比较，分析物质变化规律。2.3.1 逍遥散对肝郁证模型大鼠血清代谢组学的影响比较逍遥散+ 模型组与模型组间代谢物差异，以明确肝郁证模型大鼠经逍遥散干预后哪些代谢组分趋于正常。两组样本的 CPMG 实验 PLS-DA分析结果见图 1;LED 实验 PLS-DA 分析结果见图 2。A-得分图 B-载荷图图 1 逍遥散+模型组与模型组血浆 CPMG 核磁共
12、振氢谱的PLS-DA 分析结果图逍遥散+模型组与模型组两组样本间有明显的分组差异(图 1A、2A)。综合 CPMG 实验分析 (图 1B)和 LED 实验分析(图 2B)的结果可以得出发生浓度差异变化的主要物质。结果见表3。A- 得分图 B-载荷图 逍遥散+模型组 模型组图 2 逍遥散+模型组与模型组血浆 LED 核磁共振氢谱的 PCA 分析结果图表 3 逍遥散+ 模型组与模型组大鼠血清 CPMG 和 LED 谱中发生浓度变化的相7关代谢物2.3.2 逍遥散对大鼠代谢组学的影响比较逍遥散 +空白组与正常对照组间代谢组学差异，明确逍遥散本身对大鼠代谢组学的影响，CPMG 实验 PLS-DA 分析
13、结果见图 3;LED 实验 PLS-DA 分析结果见图 4。A- 得分图 B-载荷图图 3 逍遥散+空白组与正常对照组血浆CPMG 核磁共振氢谱的 PLS-DA 分析结果图逍遥散+空白组与正常对照组间有明显的分组差异(图 3A、4A) 。综合 CPMG 实验分析( 图3B)和 LED 实验分析(图 4B)的结果可以得出发生浓度差异变化的主要物质。结果见表 4。2.3.34 组大鼠血清代谢组学比较同时进行 4 组大鼠血清代谢组学的比较，对模型和逍遥散两个因素各自造成的代谢组学影响初步判定并比较，在总体上把握逍遥散治疗后模型大鼠血清代谢组学的变化趋势。4 组血清样本的 CPMG NMR 谱图见图
14、5，OSC-PLS分析结果见图 6;LED NMR 谱图见图 7;OSC-PLS 分析结果见图8。A- 得分图 B-载荷图 逍遥散+空白组 正常对照组图 4 逍遥散+空白组与正常对照组血浆 LED 核磁共振氢谱的 OSC-PCA 分析结果图表 4 逍遥散+空白组与正常对照组大鼠血清 CPMG 和 LED 谱中发生浓度变化的相关代谢物图 54 组大鼠血清的 CPMG NMR 谱图A-得分图 B-载荷图图 64 组大鼠血清 CPMG 核磁共振氢谱的 OSC-PLS 分析结果图从上图可以看出，4 组样本间沿第 1 主成分(t1)方向有明显的分组差异(图 6A，8A) ，其中逍遥散 +空白组与正常对照
15、组8组之间稍有差异，而逍遥散+模型组与正常对照组样本的差别较大，模型组与正常对照组组样本的差别最大。物质的变化大多呈单向改变(图 5，7)，即其余 3 组波谱与空白对照组相比，存在差异物质的波峰同时降低或升高，并且模型组波谱峰与正常对照组比较差异最大，而逍遥散+空白组最小。4 组样本间的主要差异物质见表 5。3 讨论肝郁证状态下，机体神经内分泌功能紊乱，下丘脑-垂体- 肾上腺皮质轴兴奋，会出现生长的缓慢和血浆皮质酮增高3，4 。本实验观察到 4 组间体质量增加存在显著性差异，其中模型组体质量增长最慢;也观察到逍遥散+模型组体质量增长减慢，但由于逍遥散的干预该情况得到了改善，好于模型组。皮质酮检
16、测显示模型组最高，与其余 3 组相比有显著性差异 ;逍遥散 +模型组也有一定程度升高，高于正常对照组，但经逍遥散干预后得到了改善，已经显著低于模型组了。从体质量增长和血浆皮质酮观察来看，模型组变化最大，逍遥散+模型组经逍遥散干预后这些变化得到改善，而逍遥散+模型组变化不大，与正常对照组接近。说明逍遥散对肝郁证大鼠具有治疗作用，但对正常大鼠影响不大。图 74 组大鼠血清的 LED NMR 谱图 A-得分图 B-载荷图逍遥散+模型组()、逍遥散+空白组()、模型组()、正常对照组()图 84 组大鼠血清 LED 核磁共振氢谱的 OSC-PLS 分析结果图表 53 组大鼠血清 CPMG 及 LED 谱中与9空白对照组比较代谢组学是通过对机体体液中代谢产物定量和定性分析从整体上评价生命体功能状态及其变化，反映的是基因、环境、致病因素、营养、药物、时间等诸多因素综合作用于机体后的总的反应。在中医证候的代谢组学研究中，较少采用治疗药物和/或阳性
