长霉对操作人员的危害、接种方法、推荐安全措施、去污规程、试验霉菌、导则

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1、GB/T 2423.16XXXX/IEC 60068-2-10:2005+AMD1:2018 10 A A 附 录 A （资料性） 对操作人员的危害 A.1 总则 按真菌学家和病理学家的观点，长霉试验会危害人体健康，除非采取特殊防护措施。 附录A、附录B、附录C和附录D的防护措施是在微生物学和专用设备的基础上制定的。设备操作人员 必须经过微生物试验培训。 要提供一个专用的房间来做长霉试验。 试验过程中的某些部分推荐使用微生物安全箱（MSC）。 空气中的霉菌孢子不断地从口和鼻进入人体， 一般对身体不会产生严重的危害。 但是某些敏感的人 由于反复吸入某些孢子，包括本试验中应用的孢子，而受到影响，因

2、此进行试验时注意采取防护措施。 附录C提出了防护措施的大纲。在培养过程中，培养地点或样品上可能会生长其他霉菌或微生物，作为 意外的入侵者。其中一些可能对人体有害。 对于要求承担本试验的人员，通知医师或其他医生。宜根据医疗人员的意见决定是否参与该试验。 宜对试验人员说明可能面对的与当前健康状况相关的潜在危险。 应遵守国家安全规定。 A.2 医务人员掌握的事项总则 进行本试验时，吸入孢子或伤口植入孢子会产生一定的危害。 附录C提供的安全措施，能把这种危害性降到最低。 对于易感人群会产生特定的危害： 特异敏感性患者，他们一般对花粉、灰尘、动物的皮屑等过敏，或者是患有鼻炎、哮喘或其他 过敏症。危害是可

3、能患霉菌孢子 I 型过敏，在某些环境中可能发展成为 II 型（农业肺病型）； 慢性肺部疾病（即支气管炎、慢性气管炎、结核病、肉样瘤病等）患者，一旦遇到霉菌孢子在 肺腔中沉淀和发芽繁殖，其肺部会形成霉菌球或曲霉状瘤。特别是烟曲霉会造成这种危害，结 核病治愈后的病灶，更容易受到侵害，会构成严重的霉菌生长点； 经常接受广谱抗菌素治疗的病人， 尤其是同时接受免疫抑制药物， 包括皮质酮及其他规定的化 学制剂，由于呼吸道及肠胃道里正常的细菌区系被消灭了，会促使真菌广泛繁殖，免疫抑制可 以使个别人对霉菌感染更敏感。 虽然按照规定程序进行试验危险性较低，但凡是属于以上类型的人员不宜参加本试验。 GB/T 24

4、23.16XXXX/IEC 60068-2-10:2005+AMD1:2018 11 B B 附 录 B （规范性） 接种方法 （见 12.2） B.1 总则 开始接种前，宜先学习附录C“推荐安全措施”。比较适当的方法是在样品和对照条上喷洒孢子悬 浮液。 B.2 采用喷雾接种方法（AIM）喷洒 B.2.1 总则 采用AIM方法比采用喷枪在样品表面喷洒接种分布更为均匀。 使用AIM方法时，由于孢子在样品表面分布均匀，试验结果的重复性和再现性明显要好。 使用AIM方法适用于表面很难被孢子悬浮液润湿的样品。 安全接种箱的适当尺寸为500mm500mm500mm。箱体的材料宜为聚甲基丙烯酸甲酯。 B.

5、2.2 方法描述 AIM方法见图B.1。 孢子悬浮液采用超声喷雾设备进行雾化。 为了测定孢子悬浮液的数量，在雾化室内的超声喷雾设备中引入一个分级注射器。 含有孢子的雾化液由超音速喷雾设备产生的轻微气流经一个管道带入接种箱。 雾化液经由一个装在接种箱顶部的带孔漏斗分散在箱内。 样品放在漏斗下面的箱底上，主试验面面向漏斗。 箱内的气压由2个对称安装在通气孔中的微生物过滤器进行补偿。 雾化和喷雾结束后， 利用超声喷雾设备产生的气流经由安装在箱底的阀门和微生物过滤器的管道 给箱内进行通风。 在接种箱的门（在工作时，该门是密封的）打开之前，应停止超声雾化设备产生的气流。 B.2.3 去除污染和净化 取出

6、试样后，应当立即关上接种箱的门，整个系统应当用消毒液喷雾去除污染，例如过乙酸溶液。 对于相似的孢子悬浮液，不经去污可以进行超过一次的接种操作。 如果孢子悬浮液用矿物盐溶液（方法1，见7.2.2）或者矿物盐营养液（方法2，见7.2.3）配制，雾 化设备、超声雾化器与接种箱之间的连接管、分配漏斗以及接种箱的内表面，在去污之后应当用蒸馏水 冲洗。 B.2.4 AIM 系统的校准 落在规定表面上的孢子悬浮液的数量取决于超声雾化器的调节性能以及其他因素， 可以通过分析天 平测量培养皿暴露于接种箱前后的质量变化来测定。将无机盐溶液（见7.3）雾化，而不是孢子悬浮液。 注：推荐沉积浮质量为(10020)mg

7、/dm 2。 GB/T 2423.16XXXX/IEC 60068-2-10:2005+AMD1:2018 12 B.3 通过浸渍接种小样品 对于小样品，如果孢子能粘附在其表面上，将其浸入孢子悬浮液是一种快速、有效的接种方法。 B.4 通过喷洒或涂刷接种大样品 在可能的情况下，宜按照第4章将大样品拆分分解为多单元。 如果样品对于MSC或者安全接种箱来说太大的话，宜考虑在样品上安装一个临时排气通风装置。宜 达到与MSC规定相同的气流条件、安装相同的微生物排放系统。另外，将大样品放在培养箱中，然后涂 刷孢子悬浮液是可以的。尽管该方法不能产生喷雾，但在接种期间运行推荐的排气通风系统。通过喷洒 方法接

8、种时，不宜操作排气系统以避免多余的空气运动，并且应关上门以减少孢子释散。 由于能形成雾化，推荐使用MSC进行接种。 在用AIM方法时，用安全接种箱（图B.1）代替MSC。 GB/T 2423.16XXXX/IEC 60068-2-10:2005+AMD1:2018 13 标引序号说明： 1超声喷雾设备； 2分级注射器； 3管道； 4带孔漏斗； 5过滤器； 6箱底； 7样品。 图 B.1 浮质雾化方式（AIM） GB/T 2423.16XXXX/IEC 60068-2-10:2005+AMD1:2018 14 C C 附 录 C （资料性） 推荐安全措施 C.1 安全措施宜以操作人员吸入和皮肤接

9、触霉菌孢子，特别是手指甲周围最少为原则。 1) C.2 当移动或检查样品和对照条时，扰动样品周围的空气时可能吸入霉菌孢子，例如开闭试验箱门及 容器盖，当长霉干燥时，小的菌丝碎片更容易散布在空气导致危险增加；采用喷雾接种霉菌孢子时，危 险性较大，除非采用接种箱（见附录 B）进行 AIM 接种。 C.3 直接的保护方法是使用经认证用于过滤直径范围在 1mm10mm 范围内灰尘的口罩或者是防止生物 危害和防止辐射危害的口罩，用纱布或疏松面罩达不到充分保护作用。最理想的方法是使用 MSC。 C.4 为减少霉菌跟皮肤接触的危险，在接种时和培养后，可带防护手套处理菌种、接种以及试样。用 过的手套应进行处理

10、，在处理前应进行去污。 C.5 孢子悬浮液的制备、样品和对照条的接种（如果不在接种箱内进行）等所有涉及打开霉菌容器的 操作过程以及对接种样品的检测都要在 MSC 中完成，并采取以下防护措施： a) 制备孢子悬浮液时，使用规定的润湿剂（见 7.2.1）； b) 培养容器从 MSC 中取出转送到保温箱时，需用 70的酒精擦洗容器外表面； c) 试验结束以后，仍然在 MSC 中用 70的酒精擦洗试样，除去样品外面生长的霉菌，达到最终 去污和处理； d) 使用AIM方法时， 接种箱的设计和运行应按照附录B中的规定进行以防止含有孢子的雾滴外散。 C.6 试样对于单独容器来说太大时，必须在湿度试验箱培养，

11、当开关箱门时，由于空气的扰动可能会 使空气传播霉菌孢子。 C.7 箱门打开时，带有微生物过滤器的排气系统可防止霉菌孢子外逸。当箱门关闭时，不应操作排气 系统以避免空气运动或者箱内保持负压。 C.8 培养结束后，微生物过滤器应进行去污或更换。在打开箱门之前，宜关闭排气扇以最大程度地减 少孢子分散。 C.9 进入步入式培养室时，应穿保护服及带有 C.3 规定有呼吸器的完整的头罩或用一个合适的管道将 空气通向头罩。 C.10 长霉试验用到的所有试验箱和器械使用后，宜按照附录 D 立即进行去污。 C.11 试验结束后，样品和对照条上可能长满了霉，宜注意处理。 C.12 在最后处理掉前，对照条宜浸渍在装

12、有次氯酸钠溶液的容器中（见附录 D）。在选用附录 D 中给 定的去污方法之前，样品宜当先按照 C.5 的 c)进行处理。 C.13 如果去除污染超过 28d，而怀疑试验箱和设备又不太清洁，宜在临试验前再次去清除污染。 1) IEC 原文附录 C 的条编号有遗漏，现补充。 GB/T 2423.16XXXX/IEC 60068-2-10:2005+AMD1:2018 15 C.14 实验室内不允许吸烟和饮食。 C.15 长霉实验室内穿的防护服不应穿到外面。 GB/T 2423.16XXXX/IEC 60068-2-10:2005+AMD1:2018 16 D D 附 录 D （资料性） 去污规程

13、D.1 一般说明 用于培养霉菌生长的潮湿箱和湿度容器， 可能被试验霉菌和外面侵入的霉菌污染， 因此去污染程度 是需要的，该程序对防止试验菌及侵入菌二者均有效；它不留下去污染剂的残余物，残余物很可能会干 扰试验期间接种霉菌的生长，该程序对使用者带来的危险也为最小。 D.2 推荐去污规程 D.2.1 应用化学活性溶液 用次氯酸钠溶液冲洗或者浸没，溶液中含有50010 -6100010-6的有效氯。 污染的培养空间、容器或者设备用此溶液润湿，如果可能的话，浸没于溶液中，确保溶液渗透到各 个缝隙里边，时间不少于30min，然后用清水彻底冲洗。 把气候箱的温度由60提高到70，维持1 h2 h去污。然后

14、用次氯酸钠溶液冲洗干净。 30min后，溶液的残余物宜通过冲洗或清扫以去污。 次氯酸钠具有强的漂白作用。因此，对于某些材料，可能不太合适。除次氯酸钠以外，另外一种有 效的杀菌剂是以有机氮化合物为基础的，如：醋酸苄乙胺或甲基醋酸苄乙胺。 只有杀菌效果和生物毒理安全性经过认证的杀菌剂才能使用。 D.2.2 高压蒸汽灭菌 该方法适用于耐高温的小样品和菌群。高压蒸汽锅设定条件为：压力100kPa 2)（1bar），温度121， 消毒时间20min。 D.2.3 用体积浓度70的酒精溶液喷淋擦洗 跟孢子或孢子悬浮液小液滴接触的所有表面， 用70的酒精溶液充分润湿， 作用时间不少于15min。 D.2.4

15、 应用挥发性杀菌剂 避免应用挥发性的杀菌剂，如：甲醛。甲醛蒸汽是有效的杀菌剂，但是杀菌后很难清除残余蒸汽， 并能在周围环境中引发更多的甲醛蒸汽，这样会抑制试验霉菌的生长。而且，甲醛是有毒的物质。 其他挥发性杀菌剂也是可以的，但可能存在爆炸和/或有毒等安全问题，特别是涉及到大的箱（室） 时。大多数情况下，0.5的醋酸溶液可能就是合适的去污方法。 D.3 处理 在处理掉已污染材料，剩余的菌群、孢子悬浮液等之前，用D.2.1和D.2.2的方法去污。 注：长满菌种的培养基应当用高压蒸汽灭菌。洒落的孢子悬浮液、打碎的试管玻璃以及其他失落的废弃材料在处理 之前，宜用沾满次氯酸钠溶液或D.2.1中给出的其他

16、消毒剂的棉纱覆盖几个小时进行消毒。 2） IEC 原文为“压力 10kPa (1bar)” 。 因 1bar 为 100kPa，原文有误，在此给予更正。 GB/T 2423.16XXXX/IEC 60068-2-10:2005+AMD1:2018 17 E E 附 录 E （资料性） 试验霉菌 E.1 霉菌清单 霉菌清单见表E.1。 表 E.1 霉菌清单 序号 名称 菌种菌号 相同菌种 a 1 Aspergillus niger 黑曲霉 ATCC 6275 CBS 131.52； CMI 45551； DSM 1957； NBRC 6341； NRRL 334；QM 324；QM458；IAM 3001 2 Aspergillus terreus 土曲霉 ATCC 10690 CBS 377.64；CMI 45543；DSM 1958；IFO 6346； NRRL 571；QM82j；IAM 3004 3 Chaetomium lobosum 球毛壳菌 ATCC 6205 CBS 148.51； CMI 45550； DSM 1962； NRRL 1870； QM 459；IAM 80