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1、EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定,1,实验54 E.Coli 感受态细胞的制备、质粒DNA的转化、提取与酶切鉴定,EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定,2,一. 实验目的和要求 1、通过本实验了解和掌握氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和质粒DNA转化受体菌细胞的原理与技术； 2、了解质粒DNA的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA的方法； 3、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法； 通过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、DNA转化、限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作用。,EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转
2、化提取与酶切鉴定,3,二.实验原理 1、感受态细胞制备:所谓感受态是指受体细胞处于容易吸收外源DNA的一种生理状态，可以通过物理与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞一般是限制-修饰系统（Restriction-Modification）缺陷的变异株，以防止对导入的外源DNA的切割，用符号R-M-表示。其基本原理是：细菌处于0的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经,EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定,4,过42短时间的
3、热激处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。 2、碱裂解法小量制备质粒DNA：碱裂解法是基于线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的的，在pH12.012.6的碱性环境中，线型染色体DNA和环型质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分离；当将pH值调节到中性并在高盐浓度下，已分开的染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构，通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子,EColi感受态细胞的制备质粒DN
4、A的转化提取与酶切鉴定,5,RNA和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。 3、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、III型三大类，类和III类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。类限制性内切酶结合于特定识别位点，但却随机地切割回转到被结合,EC
5、oli感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定,6,处的DNA。类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故类和限制酶在基因工程中基本不用，II类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点如下： (1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如EcoR I识别与切割序列为5GAATTC3 3CTTAAG5 (2) 、识别的核苷酸数目大多数为46个，少数识别813个； (3)、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶产生的是具有凸出的粘性末端：,EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定,7,(4)、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称
6、为同裂酶或异源同工酶，如Hpa II与Msp I；有的识别位点不同，但对DNA切割后可产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如BamH I与Bgl II。,EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定,8,影响核酸限制性内切酶活性的因素： DNA的纯度； DNA的甲基化程度； 酶切消化反应的温度； DNA的分子结构；溶液中离子浓度及种类； 缓冲液的 pH值。 4、琼脂糖凝胶电泳: 琼脂糖溶化再凝固后能形成带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质 (密度与琼脂糖浓度相关)；而生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中磷酸基团呈离子化状态，因此将核酸分子置于电场中时，它们会向正极迁移，由于糖-磷酸骨
7、架在结构上的重复性，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构象。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快。直接用低浓度的EB进行染,EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定,9,色，可确定DNA在胶中的位置。 影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素： DNA的分子大小； 琼脂糖浓度； DNA构象； 电场强度； 碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。 三实验材料
8、与设备： 1、用品与与仪器： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头 、烧杯、量筒,EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定,10,镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 吸水纸，一次性塑料手套等； E.coli DH5受体菌(R-M-)， pGEX-PDIP-r质粒(AmpR) 2、试剂： LB培养基:蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L， NaCl 10g/L，琼脂粉 1
9、5g/L（固体培养基），用10 mol/L的NaOH调节pH为7.0，高压灭菌； 氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mgmL； 含有抗菌素的LB平板培养基：将配置好的LB固体培养基高压灭菌后，冷却到60度左右，加入氨苄青霉素（终浓度为50gmL浓度50-100gmL）；,EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定,11,0.1mol/LCaCl2：称取1.1g进口无水CaCl2，溶于70mL双蒸水中，定容到100mL，过滤后灭菌； 0.1mol/LCaCl2 15甘油：100ml 0.1mol/L CaCl2 溶液内含有15ml甘油，高压灭菌； 溶液I: 50mmol/L葡萄糖，
10、10mmol/L EDTA (pH8.0)， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸，28.5mL H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA，pH8.0；,EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定,12,5TBE缓冲液：0.45mol/L Tris硼酸，0.01 mol/L EDTA, pH 8.0； 10
11、Loading buffer：1% SDS, 0.05%溴酚兰，50的甘油； 无水乙醇； 70乙醇； 标准分子量片段； 核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解缓冲液(10 buffer H)； 琼脂糖； 溴化乙啶（EB）染色液(10mg/ml)。,EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定,13,四操作步骤:,(一) 感受态细胞的制备： 1、从新活化的E.coli DH5平板上挑取一单菌落，接种于35ml LB液体培养中，37振荡培养至对数生长期(12h左右)； 2、将该菌悬液以1:1001:50转接于100ml LB液体培养基中，37振荡扩大培养，当培养
12、液开始出现混浊后，每隔2030min测一次OD600，至OD600为0.30.5时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中； 3、培养物于冰上放置20min； 4、 04，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟；,EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定,14,CaCl2纯度至关重要，不同厂家， 甚至同一厂家不同批号的产品均影响感受态的转化效率 5、04， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min； 6、 04， 4000
13、g离心10min，弃去上清液，加入100 L冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； 8、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4放置1224h，其转化效率可以增高46倍；也可加入占总体积15左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70条件下，可保存半年至一年。,EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定,15,（二）质粒DNA的转化： 1、每100L感受态细胞悬液中加入1L质粒DNA,轻轻摇匀，同时设置三组对照：(1)不加质粒，(2)不加受体菌， (3)加已知具有转化活性的质粒DNA，具体操作按下
14、表进行： *阳性对照，用已知具有转化活性的pGEX-PDIP-r质粒DNA进行转化,EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定,16,2、冰上放置2030min，然后42水浴热激90120 Sec，迅速冰上冷却2min； 3、 立即向上述Ep管中加入0.8mL LB液体培养基，摇匀后于37振荡培养约1530min ，使受体菌恢复正常生长状态及表达抗性基因； 4、取培养液50L接种于含抗菌素的LB平板培养基上，用玻璃涂棒涂匀； 5、将培养皿放在37恒温培养箱培养30 min,待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37恒温培养箱内培养过夜(14-16h) ； （三）碱裂解法小量制备
15、质粒DNA:,EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定,17,1、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，37震荡培养1216小时； 2、将1.5mL菌液加入Ep离心管中，12000 g离心30 Sec，弃上清液，在吸水纸上扣干； 离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮 3、加入100L预冷的溶液I ，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散； 溶液I中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取 过程中的机械剪切力，防止染色体DNA 的断裂；EDTA的作用是与二价离子（Ca2）结合，降低DNase对DNA的降解。 4、加入200L新配制的溶液II, 盖
16、紧管口,快速颠倒离心管,以混匀内容物,冰上放置35min; 溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变 性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状结构,EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定,18,5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置23min； 溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部 分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性 6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep管中； 7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀，室温放置2min. 8、 12000g离心10min，弃上清液，再用70的乙醇洗涤一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含20 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约8min)，存于20或直接用于酶切。,EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定,19,质粒图谱:,EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定,20,(四)提
