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1、编辑ppt,PCR技术及其应用,1 PCR技术原理 2 PCR技术应用,编辑ppt,PCR技术简史,DNA的复制 聚合酶链反应的发明,编辑ppt,PCR技术简史,DNA的复制 聚合酶链反应的发明,Kary B. Mullis, ，1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年，Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,编辑ppt,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,特定DNA片段,编辑ppt,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,
2、100 80 60 40 20,编辑ppt,二、PCR的基本原理,PCR基本原理 类似于DNA的体内复制。在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR的基本步聚 1、变性 (Denaturation) ：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA 。 2、退火 (Annealing) ：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。 3、延伸 (Extension )：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及Mg2+存在条件下，53的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。 这
3、种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,编辑ppt,72,94,55,PCR循环(30-40),变性,退火,延伸,PCR反应程序,编辑ppt,PCR反应程序,编辑ppt,编辑ppt,PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95),Target Sequence,Target Sequence,PCR原理示意图, 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,A
4、TCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,加热94,编辑ppt,引物酶, 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences,Target Sequence,Target Se
5、quence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,引物酶,3,5,3,5,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,引物,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,引物,3,5,5,3,编辑ppt,PCR Cycle - Step 3 - At 72 Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,
6、3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA Polymerase, 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。,3,5,3,5,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,DNA 聚合酶,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,DNA 聚合酶,5,5,3,3,引物,引物,编辑ppt,End of the 1st PCR Cycle Resu
7、lts in two copies of target sequence,Target Sequence,Target Sequence,每完成一个循环需2-4 min， 2-3 h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,3,5,3,5,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,5,5,3,3,编辑ppt,Target Amplification,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of
8、Target 12 24 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,编辑ppt,三、PCR反应,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,编辑ppt,PCR仪,编辑ppt,PCR仪,编辑ppt,PCR仪,编辑ppt,PCR反应过程,PCR反应条件 PC
9、R过程 PCR的特点,编辑ppt,模板DNA,编辑ppt,PCR反应过程,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,编辑ppt,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,编辑ppt,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,编辑ppt,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,编辑ppt,PCR的基本原理,PCR反应条件
10、PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,编辑ppt,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第2轮结束,编辑ppt,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2n n 循环次数 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数,编辑ppt,PCR反应的特点,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,编辑ppt,1、PCR反应成分,1）模板 单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一
11、条cDNA。 模板不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100l。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。最好做浓度梯度对照从而确定最佳条件。,四、PCR反应体系,模板 引物 Taq DNA聚合酶 4种dNTP混合物 Mg2+ 10缓冲液,编辑ppt,2）引物 （1）浓度 0.1-0.5 M 浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。,引物是PCR特异性反应的关键； PCR产物的特异性取决于引物与模板脱氧核糖核酸互补的程度； 人工合成的寡聚核苷酸引物需经离子交换HPLC进行纯化。,编辑ppt,引物在反应中的浓度要一致。如果引物浓度较大,在
12、PCR产物检测时,在溴酚兰前面可以看到1条引物带(由于前后引物等大小)。如果引物太少,使得非特异性扩增发生,从而出现杂带。不同试验对浓度的要求也不一样,而引物浓度大对特异性PCR的结果影响不大,但是会造成试剂的浪费; 引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体，二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pM/ L较好。,编辑ppt,（2)PCR引物的设计一般原则 根椐待扩增的DNA片段，设计其特异的上、下游引物, 引物长度一般以18-30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起
13、引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。 避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。 G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在40-60%之间，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带；ATGC尽可能选择碱基随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶连续排列。 要避免两个引物间特别是3末端碱基序列互补以及同一引物自身3末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。,编辑ppt, 引物3末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3末端为G、C或T时引发效率较高。 引物5末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核
14、酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。 引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。 引物量： 每条引物的浓度0.1-1 Ml或10-100 pM，以最低引物量产生所需要的结果为好 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会,编辑ppt,3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 目前有两种Taq脱氧核糖核酸聚合酶供应： 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯； 基因工程酶：大肠菌合成； 一般0.5-2.5 U/50l； 酶量过少影响反应产量；浓度过高可引起会造成杂带、特异产物带不清晰等不好的结果，浓度过
15、低则得不到所需的产物。最可靠的做法是先做浓度对照,再根据结果决定最佳条件。,编辑ppt,4）dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP 4） dNTP浓度取决于扩增片段的长度; 四种dNTP浓度应相等; PCR常用的浓度为50-200M，不能低于10-15M。 浓度过高会抑制Taq 酶的活性，易产生错误碱基的 掺入，浓度过低则降低反应产量; dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影 响DNA聚合酶的活性。,编辑ppt,dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0-7.
16、5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解； 在PCR反应中，dNTP应为50-200 M，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制）， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。,编辑ppt,5）Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200 M/L时，Mg2+浓度为1.5-2.0 mM/L为宜Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高反应特异性降低，出现非特异扩增，就会出现红彤彤一片涂布。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,编辑ppt,6）10PCR缓冲液： 500 mM KCl， 100 mM Tris-HCl (pH 8.4)， 150 mM MgCl2 ， 1 mg/ml明胶。,编辑ppt,PCR反应体系： 10PCR buffer 10l dNTP mix 各200M 引物1 1M 引物2 1M DNA模板 50ng-1g Taq 酶
