《chk1反义寡核苷酸增加HeLa细胞顺铂作用下凋亡敏感性-2016年最新医学论文》由会员分享，可在线阅读，更多相关《chk1反义寡核苷酸增加HeLa细胞顺铂作用下凋亡敏感性-2016年最新医学论文（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询chk1 反义寡核苷酸增加 HeLa 细胞顺铂作用下凋亡敏感性作者：朱克修，王佳，李玢，曹亚莉，韩晓兵 【摘要】 目的：通过反义封闭 chk1 基因，阻断细胞周期检测点信号传导通路，从而增加宫颈癌 HeLa 细胞对顺铂(DDP)的敏感性. 方法：采用 MTT 法检测梯度浓度 DDP 作用人宫颈癌细胞株 HeLa 24,48 和 72 h 后对细胞的生长抑制率. 以脂质体为载体将 chk1 正义链和反义链转染 HeLa 细胞，用 Western Blot 测量 Chk1 蛋白的表达，用流式细胞仪和 TUNEL 法检测 DDP 作用后细胞凋亡率.
2、 结果：DDP 对 HeLa 细胞有生长抑制作用，并有时间和浓度依赖性. 反义封闭 chk1 基因可抑制 Chk1 蛋白表达（P 0.01） ， DDP 作用下细胞凋亡率为 54.1%,高于转染正义链的 34.2%（P 0.01）. 结论：反义封闭 chk1 基因可增加 HeLa 细胞对 DDP 的凋亡敏感性. 【关键词】 Chk1 基因；反义核酸技术；宫颈肿瘤；顺铂 【Abstract】 AIM: To investigate the effect of chk1 gene in cisplatinresistance of cervical cancer to block the sign
3、al transduction pathways of cell cycle checkpoint, by targeting chk1 gene using antisense oligonucleotide, so as to enhance the drug sensitivity of cervical cancer HeLa cells to DDP. METHODS: The proliferation inhibition rates 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询of HeLa cells by DDP in different concentration
4、s were measured by MTT assay. Oligonucleotide was transfected into HeLa cells.The expression of Chk1 was observed by Western Blot. The apoptosis rate of HeLa cells induced by DDP was investigated by flow cytometry and TUNEL. RESULTS: The growth inhibition rate of HeLa cells increased gradually in a
5、time and concentration dependent manner. Transfection with antisense oligonuleotide targeting chk1 inhibited the expression of Chk1 protein (P 0.01), and the apoptosis rate (54.13%) was significantly higher than that of the sense blocking (34.20%, P 0.01). CONCLUSION: Antisense blocking of chk1 incr
6、eases the apoptosis sensitivity of HeLa cells to DDP. 【Keywords】 chk1 gene；antisense nucleic acid technology; cervix neoplasms; DDP 0 引言 宫颈癌是世界范围内女性第二大恶性肿瘤. 近年来以顺铂（cisplatin，DDP）为核心的联合化疗在宫颈癌治疗中取得了一定进展. 有研究认为，细胞周期检测点途径主要由ATM，ATRChk1/2Cdc25A ，Cdc25B，Cdc25C 轴组成1 ，细胞周期检测点激酶 1(checkpoint kinase1，Chk1)属于丝
7、氨酸/苏氨酸激酶,是细胞周期检测中最关键的效应蛋白激酶2. 以 chk1 为作用精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询靶点,干扰细胞损伤修复机制,提高肿瘤治疗的敏感性可能成为一种有效的治疗选择. 我们以 chk1 反义寡核苷酸链转染 HeLa 细胞，观察其化疗后的凋亡敏感性. 1 材料和方法 11 材料 人宫颈癌 HeLa 细胞株由西安交通大学医学院第一附属医院临床研究医学分子中心提供. 在 37, 50 mL/L 的 CO2 条件下用含 100 mL/L 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基培养. RPMI 1640 购自 Gibco 公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料
8、有限公司；MTT 购自Amressco 公司；转染试剂 LipofectamineTM 2000 购自美国Invitrogen 公司；鼠抗人 Chk1 mAb 购自 Neomarkers 公司；辣根酶标记的羊抗鼠抗体购自博士德公司；ECL 购自 Amersham Bioscience公司；Annexin VFITC 试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；原位细胞凋亡检测试剂盒购自华美生物公司. 12 方法 实验分 4 组：正常对照组(A 组)，细胞未经任何处理；空脂质体组(B 组)；转染 chk1 正义寡核苷酸链组(C 组)；转染 chk1 反义寡核苷酸链组(D 组). BD 组转染后用 20
9、 mol/L DDP 处理 24 h. 121 MTT 法检测 DDP 对细胞的生长抑制率取对数生长期的 HeLa 细胞，调整细胞密度 5107/L，接种于 96 孔板, 200 L/ 孔,培养 24 h 后 DDP 终浓度为 10,20,40,80 和 160 mol/L,每个浓度设 4 个平行孔，并同精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询时设阴性对照(不加药物)和空白对照（无细胞） ，分别于作用 24,48和 72 h 后加入 5 g/L 的 MTT 溶液，20 L/孔，继续培养 4 h 后，吸去上清，加入二甲基亚砜，150 L/孔，振荡器震荡 10 min，使结晶溶解完全，
10、用酶标仪在 490 nm 波长处测量 A 值，计算细胞增殖抑制率（%）. 绘制 DDP 对 HeLa 细胞的生长抑制曲线. 122 转染效率的检测 chk1 反义寡核苷酸序列根据参考文献3-4的方法，由上海生工生物技术服务有限公司合成，序列为：chk1 反义链：5GGCACTGCCATGACTCCA 3;正义链：5TGGAGTCATGGCAGTGCC3, 采用全硫代修饰，部分寡核苷酸链的 5端以 FITC 标记. 严格按照 LipofectamineTM 2000 试剂说明书进行转染，于转染前 1 d 用无抗生素的含 100 mL/L 胎牛血清的RPMI 1640 调整细胞密度为 2.5108
11、/L，接种于 24 孔板，500 L/孔. 转染当天换为 500 L 无抗生素无血清 RPMI 1640. 分别取不同量的荧光标记的寡核苷酸链(0.6,0.8 和 1.0 g)加到 50 L 的RPMI 1640 中，混匀. 再取 LipofectamineTM 2000 2 L，加到 50 L 的 RPMI 1640 中混匀 . 室温放置 5 min 后，将分别混有寡核苷酸链和 LipofectamineTM 2000 的 RPMI 1640 混合，室温放置 20 min（寡核苷酸链与脂质体比值分别为 0.6 g2 L；0.8 g2 L 和 1.0 g2 L）. 将上述混合物加入 24 孔板
12、中，轻轻混匀，培养 6 h 后,将培养基换为 500 L 含 100 mL/L 胎牛血清的 RPMI 1640，继续培养至 24 h，荧光倒置显微镜下观察转染效精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询率. 123 Western Blot 法检测 Chk1 蛋白表达裂解提取 HeLa 细胞总蛋白，按 Bradford 法进行蛋白定量，煮沸 5 min 使蛋白变性，120 g/L 的 SDSPAGE 电泳分离后，湿转到硝酸纤维素膜上，将膜置于 50 g/L 脱脂奶粉中室温封闭 1 h，以鼠抗人的 Chk1 mAb 按 1400 室温孵育 1.5 h，用 TBST洗膜 6 次，每次 3
13、 min，再与辣根酶标记的羊抗鼠二抗 1500 室温孵育 1 h，TBST 洗膜 6 次，每次 3 min,以 ECL 显色,X 光胶片暴光，洗片. 用凝胶成像系统检测蛋白表达灰度值. 124 细胞凋亡的检测 收集细胞，调整细胞浓度为 1108/L,取细胞 1 mL，PBS 洗涤后将细胞悬于 Binding Buffer 200 L，加 Annexin VFITC 10 L，混匀，室温避光孵育 15 min，再加入 Binding Buffer 300L和 PI(碘化丙啶) 5 L，流式细胞仪检测细胞凋亡 . 另将 HeLa 单细胞悬液接种于 24 孔培养板培养，使细胞爬于盖玻片，按上述各组方
14、法处理细胞后捞出盖玻片，40 g/L 多聚甲醛固定，按 TUNEL 试剂盒说明进行操作. 统计学处理：重复 3 次实验，实验结果采用 SPSS 13.0 统计软件进行方差分析及两两比较，P 0.05 为差异具有统计学意义. 2 结果 21 DDP 对 HeLa 细胞的生长抑制作用结果显示，A 组 HeLa 细胞体外生长良好，10 mol/L DDP 作用 HeLa 细胞 24 h 后抑制效应不精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询明显，20，40，80 和 160 mol/L DDP 对 HeLa 细胞有抑制效应，且随着时间的延长和浓度的增加，其抑制作用越来越明显，呈时间浓度依赖
15、性特点（图 1）. 由于 20 mol/L DDP 作用 24 h 后对细胞已有明显的抑制作用，因此后面的实验中选用 20 mol/L 为药物处理浓度. 22 寡核苷酸转染效率用 FITC 标记的寡核苷酸转染 HeLa 细胞，24 h 后用荧光倒置显微镜观察转染效率，发现DNA/LipofectamineTM 2000 脂质体比率为 0.6 g2 L；0.8 g2 L 和 1.0 g2 L 时的转染效率分别为98.9%，99.8%，99.0%，其中 DNA/LipofectamineTM 2000 脂质体比率为 0.8 g2 L 时转染效率最高. 23 HeLa 细胞 Chk1 蛋白的表达转染
16、 chk1 反义寡核苷酸可明显抑制 Chk1 蛋白的表达（图 2） ， 与 A 组， B 组和 C 组比较差异具有统计学意义（P 0.01）. 24 chk1 反义寡核苷酸对顺铂作用下 HeLa 细胞凋亡的影响转染 chk1 反义寡核苷酸后 DDP 诱导的细胞早期凋亡和晚期凋亡总共有(54.11.0)%, P 0.01 ，高于 C 组(34.21.0)%, P 0.01 ，说明转染 chk1 反义寡核苷酸可增加 DDP 诱导的 HeLa 细胞凋亡. TUNEL 染色显示,转染 chk1 反义寡核苷酸链后 HeLa 细胞在 DDP 作用下凋亡率为 57.2%，是 C 组凋亡率（24.9%）的 2.3 倍，检测结果与Annexin V/PI 流式细胞仪检测法获得结果一致（图 3）. 上一页 1 2 下一页精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主
