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1、实验一 质粒DNA的提取及检测,质粒（plasmid）,是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等 质粒的复制：严紧型复制（1n个） 松弛型复制（20个以上）,常用的质粒载体,是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18, pUC19,质粒提取的思路,质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA 要去除的物质： 蛋白 基因组DNA 脂类及小分子杂质 RNA,第一部分质粒DNA的提取,一目的,了解提取质粒的原理。 学习和掌握质粒提
2、取的方法和技术。 细菌的生长和质粒的扩增 菌体的收集裂解及质粒DNA的分离 质粒DNA的纯化,二原理,碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异： 在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态； 将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA（可省略）。,原理示意图 返回目录 返回原理
3、,三、实验仪器、材料与试剂,（一）仪器：恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅 （二）材料：含pUC18（或其他）质粒的大肠杆菌、 （三）试剂： LB培养基（液体、固体） 溶液I 溶液II 溶液III TE(pH8.0),溶液 I,50 mmol/L 葡萄糖/1mg/mL溶菌酶 25 mmol/L TrisCl (pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0) 在10 lbf/in2(6.895104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4。 作用：裂解细胞，鳌合金属离子使金属酶失活,溶液 II,0.2 mol/ L NaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释) 1% SDS 作用：细胞壁肽
4、聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。,溶液 III,5mol/L 乙酸钾60ml 冰乙酸11.5ml 水28.5ml 所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。 作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS线性DNA沉淀，K可中和DNA,TE(pH8.0),10 mmol/L TrisCl (pH8.0)1 mmol/L EDTA (pH8.0) RNA酶（降解RNA） 作用：稳定,特点：小量质粒制备、最简便、快捷 应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提） 测序、转染（细提）,质粒提取试剂盒,常用方法：小量碱裂解法,满足不同需要的试剂盒,纯化原理：离子交换柱层析等,小量制备
5、质粒kit,大量制备质粒kit,去除内毒素制备质粒kit,可用于大部分分生实验,四、实验步骤,接含pUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 370C，190rpm振荡培养过夜 取1.5 ml菌液入1.5ml的离心管中 6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体 100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温10min 加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体, 加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性 12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管 上清加等体积的酚：氯仿（振荡混匀） 12000rp
6、m，离心15min，取上清记录体积到一新管 ,上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴 30min 12000rpm，离心15min 沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（轻弹混匀、离心） 12000rpm，离心10min 晾干沉淀 沉淀用20ul TE溶解,沉淀法,吸附管用BL 500ul平衡 取上清加入吸附管 5000rpm 离心5min 加PW漂洗液500ul，放置2min 10000rpm 离心5min，晾干 加30ul TE，10000rpm 离心5min（收集到干净的EP管中）,吸附法,第二部分琼脂糖凝胶电泳,相关知识,电泳：泳动速度决定于？ 琼脂糖凝胶 天然琼脂（Agar）是一种多聚
7、糖，主要由琼脂糖（Agarose ，约占80）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。,琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围,核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系,不同构型DNA的移动速度依次为：共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。,影响迁移
8、率的因素,DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压（一般5V/cm）、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成等。,一、实验目的,通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。,二、实验原理,DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 核酸为两性分子，在pH3.5时，整个分子带正电,pH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小
9、。 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。 共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。,质粒的电泳,质粒DNA的3种形式泳动速度:超螺旋线性开环,质粒DNA的存在形式有3种: 1、共价闭环DNA:常以超螺旋形式存在 2、开环DNA:质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子 3、线性DNA:因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.,开环,超螺旋,线性,三、仪器、材料与试剂,（一）仪器：稳流稳压电泳仪 （二）材料 1.自已提取的质粒DNA 2.相对分子
10、质量标准品 （三）试剂 15TBE储液(pH8.0)使用时稀释 10倍，成1TBE。 2凝胶加样缓冲液（loading buffer） 3. 1% 琼脂糖 4. 10mg/ml溴化乙锭溶液（EB），4保存。用时稀释成 5ug/ml的EB。,四操作步骤,琼脂糖（1%）凝胶电泳 称取一定量琼脂糖凝胶，按1g中100ml的量加入电泳缓冲液，微波炉中加热约2min，使琼脂糖溶解； 溶液冷至60 ，加入 EB至终浓度为0.5g/ml，混匀，注意戴手套操作； 将琼脂糖倒入电泳板中，使凝胶厚度约为0.3-0.5cm，迅速插上梳子，检查有无气泡； 待凝胶完全凝固后（约30min），小心取出梳子，将凝胶板置于电
11、泳槽中，加入电泳buffer，让液面高出胶面1mm； 在DNA样品（20ul）中加入6 loading buffer（4ul），混匀后用移液枪将样品加入样品孔中电泳，电压100V ； 根据指示剂的位置，判断是否终止电泳; 在紫外灯下凝胶成像仪上观察电泳结果。,五、实验结果与讨论,根据观察结果，绘图。 分析自提质粒的情况。,图1的电泳结果不是很好，一方面上样量太大不同构象的质粒分子没有分开；另一方面有些样品RNA去除得不好，在电泳结果上可以看到大团的荧光；此外还要注意上样的技巧，上样后稍沉降一会，使样品均匀地分布于上样孔的底部再开始电泳，这样走出的条带会较均匀。图2的结果较好。,六注意事项,为提高质粒产量，要注意下面两个步骤： 加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮； 加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒510次) ，使蛋白质和核酸变性； 加溶液III后pH要达到中性(轻柔振荡510次 )，使质粒DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。,
