《114例HBsAg阳性孕妇及其新生儿PBMC 感染HBV的状况-2016年最新医学论文》由会员分享，可在线阅读，更多相关《114例HBsAg阳性孕妇及其新生儿PBMC 感染HBV的状况-2016年最新医学论文（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询114 例 HBsAg 阳性孕妇及其新生儿 PBMC 感染 HBV 的状况作者：王效军 王素萍 李铁钢 冯永亮 【关键词】 外周血单个核细胞；乙型肝炎病毒；原位杂交 【摘要】 目的：了解 HBsAg 阳性孕妇及其新生儿 PBMC HBV 感染状况。方法：采用原位杂交(ISH)技术检测 114 例孕妇和新生儿PBMC 涂片中 HBV DNA。结果：114 例 HBsAg 阳性孕妇及其新生儿PBMC HBV DNA 的检出率分别为 28.07%（32/114）和32.46%（37/114） ；HBsAg 阳性孕妇与其新生儿之间的 PBMC HBV
2、 感染存在一致性（Kappa=0.52, P 0.01） 。结论：证实 HBsAg 阳性孕妇与其新生儿之间的 PBMC HBV 感染存在一致性。 【关键词】外周血单个核细胞；乙型肝炎病毒；原位杂交 【Abstract】Objective：To observe the status of HBV infection in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from the HBsAgpositive mothers and their neonates. Methods：In situ hybridization (ISH) was used t
3、o detect HBV DNA in PBMC smear from 114 HBsAgpositive mothers and theirs newborns. Results：The positive rates of the PBMC HBV infection of the mothers and their neonates were 28.07% and 32.46%, 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询respectively. There was an agreement of the HBV infection status between the mot
4、hers and their newborns (Kappa=0.52, P 0.01). Conclusion：The result suggests that the HBV infection status from the mothers agrees with that from their newborns. 【Key words】 peripheral blood mononuclear cells; hepatitis B virus; in situ hybridization 乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）宫内感染是导致我国HBsAg 慢性携带的重要
5、原因，HBV 宫内传播是 HBV 宫内感染的重要途径，其机制复杂多样。临床上乙肝疫苗（hepatitis B vaccine，HBVac）和乙肝免疫球蛋白（hepatitis B immune globulin，HBIG）的联合应用不能完全阻断 HBV 母胎之间的宫内传播（intrauterine transmission） ，有研究1证实在 HBsAg 阳性孕妇及其新生儿外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中均可检出 HBV 复制中间体（covalently closed circular, cccDNA） 。HBV 感染 PBM
6、C，影响机体体液免疫和细胞免疫状态，导致 HBV 持续感染或反复感染。史晓红等2曾对新生儿 HBsAg 阳性孕妇新生儿 HBV 感染作过研究。为进一步了解孕妇及其新生儿 PBMC 感染 HBV 的状况，本文采用原位杂交（ISH）技术对此进行了研究，现将结果报道如下。 1 对象与方法 1.1 研究对象 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询以 2003 年 7 月至 2004 年 11 月在太原市传染病院妇产科进行产前检查并分娩的 HBsAg 阳性孕妇及其新生儿为研究对象。采集孕妇分娩前肘静脉血和新生儿出生 24 h 内未注射乙肝疫苗的股静脉血，EDTA 抗凝，抗凝血于 4 保存备
7、用。 1.2 实验室检测 1.2.1 PBMC 涂片的制备 抗凝血加等量 Ficoll 淋巴细胞分离液，2000r/min 离心 30 min；吸取单核细胞层于另一试管，加 2 mL Hank，s 平衡盐溶液，1000 r/min 离心 10 min，再重复洗涤 2 次 ；洗涤后的细胞用 30LHank，s 溶液制成细胞悬液；取 510L涂于经 APES（3 氨丙基 3 乙氧基甲硅烷）防脱处理的载玻片上；70%乙醇固定，自然晾干，4 保存备用。 1.2.2 HBV S 基因探针的制备 （1） PCP10HBV DNA 重组质粒DNA 的提取： 吸取 1.01.5 mL 复苏的 PCP10 质粒
8、培养液于 1.5 mL离心管中，4 下 14000 r/min 离心 30 s；吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥；将细菌沉淀重悬于 0.5 mLSTE，4 下 14000 r/min离心 1 min；吸去上清，使细菌沉淀尽可能干燥；将细菌沉淀重悬于冰预冷的溶液中，剧烈震荡后加入 200L 新配制的溶液（盖紧管口，快速颠倒 5 次，不要震荡） ，置于冰上 3 min；加 150 L冰预冷的溶液（盖紧管口，将管倒置后温和地震荡 10 s，之后将管置于冰上 35 min） ，4 下 14000 r/min 离心 10 min，将上清转移至另一 1.5 mL 离心管中；加 1 倍上清体积的酚:氯仿(1
9、1)，震荡混匀，4 下 14000 r/min 离心 2 min，将上清转移至另一 1.5 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询mL 离心管中；加 2 倍上清体积的 95%乙醇，振摇混合，室温静置 2 min，14000r/min 离心 10 min；小心吸去上清，离心管倒置于滤纸上，使所有液体尽量流出，再用滤纸除尽附于管壁的液滴；再加入70%乙醇 1mL，4 下 14000 r/min 离心 5 min 以洗涤 DNA 沉淀；再小心吸去上清，离心管倒置于滤纸上，使所有液体尽量流出，用滤纸除尽附于管壁的液滴，空气中干燥 10 min，30LTE 缓冲液溶解，-20 保存。 （2
10、） HBV S 基因双链 DNA 裸探针的制备及标记：采用PCR 法扩增 HBV S 基因，引物选自 HBV S 基因启动子和终止子附近的保守序列3 （189689 nt） ，由上海生工生物工程技术有限公司合成，扩增片断长度为 500 bp，引物序列为： HBV SP1 5CCT GTC CGT GTT ACA GGC 3 （上游引物） HBV SP2 5GGC ATC AGT AAA CTG AGC 3 （下游引物） 以提取的 HBV DNA 为模板，以 P1 、P2 为引物，总反应体积50L，具体反应体系包括：10Buffer 5L、0.025 mol/L MgCl2 4L、0.01mol
11、/L dNTP1L 、HBV SP1 1L、HBV SP2 1L、Taq DNA 聚合酶 0.2L、模板 DNA 5L、无菌水定容至 50L，2 滴无菌石蜡油封顶，瞬时离心后，置于 PCR 扩增仪进行 DNA 扩增，循环参数为：94 预变性 300s，94 变性 50 s，55 退火 50 s，72 延伸 50 s，35 个循环，72 终延伸 300 s，取扩增产物10L 与上样缓冲液混匀,在 1.2琼脂糖凝胶(含 0.5 mg/LEB)上电泳，5v/cm，20 min 后在紫外灯下观察，与 DNAmarker 比较，在 501 bp 附近出现橙红色均一条带为阳性，否则为阴性。紫外灯下回收阳精
12、品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询性电泳凝胶块，DNA 纯化试剂盒分离纯化，回收 HBV S 区片断，取少量样品用紫外可见分光光度计定量，以无菌水溶解至约 100300 mg/L 即得到 HBV S 区双链 DNA 裸探针，参照 Roche 公司 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit 说明书进行探针标记，20 保存。 上一页 1 2 下一页1.2.3 原位杂交 （1）操作步骤：细胞常规入水 5 min，0.01 mol/LPBS 漂洗 3 min2；0.2 mol/L HCl 室温消化 15 min，0.01
13、 mol/L PBS 漂洗 3 min3；10 mg/L 蛋白酶 K37 消化 20 min，含0.2%甘氨酸的 0.01 mol/L PBS 室温终止 10 min，0.01 mol/L PBS漂洗 3 min2；梯度乙醇（80%、85%、90%、95%、100%、100%各 5 min）脱水，自然风干；加杂交液（含 800 mg/L 的标记 HBV DNA 探针，用前 42 预热 30 min） ，以 25 L/片滴于 PBMC 涂片，其上加一盖玻片，95100 变性 10 min, -70 冰面骤冷 5 min,然后42 孵育 20 h 以上；洗片，依次用 2SSC、1SSC、0.5SS
14、C 振洗及漂洗；封闭液 37 孵育 30 min；加抗地高辛碱性磷酸酶标抗体（1500） ，30 L /片 37 孵育 22.5 h，0.01 mol/LPBS 漂洗 3 min3；NBT/BCIP(30L/片)暗处显色 35 h；蒸馏水冲洗10 min、甩片；核固红 1 滴衬染 1 min；蒸馏水冲洗 3 min3；透明，依次用 75%、85%、95%乙醇各 2 min，无水乙醇 3 min2，二甲苯、二甲苯各 2 min；中性树胶封片；镜检照相。 （2）对照精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询设置：阳性对照，PCR 证实 HBV DNA 阳性的 PBMC 细胞涂片； 阴性对
15、照，未标记的 HBV S 区基因裸探针对照；PBS 空白对照。以粉红色细胞中出现深紫色信号判断为阳性，只见粉红色细胞的判断为阴性。 1.3 统计学处理 用 SPSS 12.0 进行统计学分析，采用一致性检验。 2 结果 114 例孕妇及其新生儿 PBMC 中 HBV 的感染率分别为28.07%（32/114）和 32.46%(37/114)，32 例 PBMC 阳性孕妇新生儿有 23 例 PBMC HBV DNA 阳性,82 例 PBMC 阴性孕妇新生儿有 14 例PBMC HBV DNA 阳性,孕妇 PBMC HBV 感染与新生儿 PBMC HBV 感染之间存在一致性（Kappa=0.52,
16、 Z=5.62, P 0.01）,详见表 1。 表 1 HBsAg 阳性孕妇与新生儿 PBMC HBV 感染的关系 3 讨论 20 世纪 80 年代以后，学者们从乙型肝炎患者的肝外组织和细胞中发现有 HBV 的存在与表达，以 PBMC 中 HBV 感染的研究相对较多。PBMC 是包括淋巴细胞、单核细胞以及 NK 细胞等免疫活性白细胞的集合体，在机体的免疫应答中担负重要的免疫功能。HBV 感染 PBMC后能改变其分泌功能，影响机体的细胞和体液免疫。因此，PBMC HBV 感染对乙肝病毒的清除、持续携带以及免疫耐受等结局将起重要作用。本文应用 ISH 在孕妇及新生儿 PBMC 中均检出 HBV DNA，证实了 PBMC 可作为 HBV 的隐匿场所。 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询PBMC HBV 感染的检测以孕妇 PBMC 较多4 ，新生儿
