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1、 浅部真菌病病人的致病菌种探究 摘 要：目的 了解皮肤科就诊病人浅部真菌病病种及其致病菌种的构成与分布情况。方法 2018年5月2019年5月，我院皮肤科门诊就诊、具有典型浅部真菌病临床特征、真菌镜检及培养均为阳性病人528例，取病人皮损标本进行分离培养，通过形态观察、质谱检测系统进行菌株鉴定，对少见及疑难菌株行核糖体DNA(rDNA)ITS区序列测定。结果 528例皮肤浅部真菌病病种前3位依次是甲真菌病132例（25.00%）、足癣115例（21.78%）、股癣83例（15.72%）。分离出的致病真菌中红色毛癣菌居首位（250株，47.35%），其次为须癣毛癣菌92株（17.42%）。不同性
2、别、年龄段浅部真菌病病种的构成和分布存在一定差异，其中股癣及体癣男性构成比明显高于女性（2=33.905、8.705,P0.05），甲真菌病及足癣女性构成比高于男性（2=22.381、9.488,P0.05）；股癣、马拉色菌毛囊炎病人主要集中在2130岁年龄段，甲真菌病、花斑糠疹以3140岁病人为主，而头癣的发病年龄高峰为10岁，差异均有统计学意义（2=6.24515.709,P0.05）。结论 本院皮肤科浅部真菌病病人中甲真菌病为最常见病种，浅部致病真菌以皮肤癣菌为主，红色毛癣菌为优势致病菌。关键词：真菌病; 真菌; 癣; 真菌学分型技术;Abstract：Objective To inve
3、stigate the composition and distribution of superficial mycosis diseases and their pathogenic fungi in patients in Department of Dermatology Methods A total of 528 patients with typical clinical features of superficial mycosis and positive results of microscopic fungal examination and culture who at
4、tended the outpatient service of Department of Dermatology in our hospital from May 2018 to May 2019 were enrolled.Skin lesion specimens were collected for isolation and culture,and morphological observation and mass spectrometry were used for strain identification.The sequence of ribosomal DNA(rDNA
5、)ITS was determined for rare and difficult strains Results Among the 528 patients with superficial mycosis,132(25.00%)had onychomycosis,115(21.78%)had tinea pedis,and 83(15.72%)had tinea cruris.Among the pathogenic fungi isolated,Trichophyton rubrumranked first(250 strains,47.35%),followed by Tricho
6、phyton mentagrophyte(92 strains,17.42%).There were some differences in the composition and distribution of superficial mycosis diseases between the patients with different sexes and ages;the male composition ratios of tinea cruris and tinea corporis were significantly higher than their female compos
7、ition ratios(2=33.905,8.705;P0.05),and the female composition ratios of onychomycosis and tinea pedis were significantly higher than their male composition ratios(2=22.381,9.488;P0.05);most of the patients with tinea cruris and Malassezia folliculitis were mainly observed in the age group of 21-30 y
8、ears,and onychomycosis and pityriasis versicolor were mainly observed in the patients aged 31-40 years,while most of the patients with tinea capitis were observed in the age group of10 years(2=6.245-15.709,P0.05) Conclusion Onychomycosis is the most common type of superficial mycosis diseases in our
9、 hospital.Dermatophytes are the main pathogenic fungi for superficial mycosis,with Trichophyton rubrum as the dominant pathogenic fungus.Keyword：mycoses; fungi; tinea; mycological typing techniques;皮肤浅部真菌病为皮肤科常见疾病，其致病菌的分布特点因地域环境、社会经济条件及生活习性等不同而有所差异。为了解我院皮肤科门诊病人浅部真菌病及其病原真菌构成与分布特点，本文对就诊于我院皮肤科门诊的528例浅部
10、真菌病病人进行病种及致病菌种分析。1 、资料与方法1.1、 一般资料2018年5月2019年5月，在我院皮肤科门诊就诊、具有典型浅部真菌病临床症状并且真菌镜检及培养均为阳性病人528例，其中男305例，女223例；年龄181岁，平均（37.306.29）岁。1.2、 真菌镜检及培养取病人病变部位的皮屑、甲屑、毛发或分泌物等。真菌镜检：将标本置于载玻片上，加1滴100g/L氢氧化钾，覆盖盖玻片，光学显微镜下观察，找到菌丝或孢子为镜检阳性。真菌培养：将真菌镜检阳性的标本接种于含0.05g/L氯霉素的沙氏培养基中，置于28恒温培养箱内双管培养，期间每周观察3次菌落生长情况，第4周未见真菌生长者为阴性
11、。念珠菌转种科玛嘉念珠菌显色培养基，疑似花斑糠疹或马拉色菌毛囊炎病人标本接种于含橄榄油培养基中，37培养35d。1.3、 菌株鉴定1.3.1、 形态学鉴定根据菌落的形态特征及其颜色、生长速度、分生孢子的形态及菌丝特征等进行初步鉴定。1.3.2、 质谱检测系统鉴定对纯培养菌落应用全自动快速微生物质谱检测系统进行鉴定，根据Biotyper软件得分标准进行结果判读：属的鉴定阈值下限为1.7，种的鉴定阈值下限为2.0。记录得分2.0的菌株，得分1.7的菌株进行重复分析，最终仍未得到确切结果的菌株进行分子生物学鉴定。1.3.3、 分子生物学鉴定对少见及疑难菌株行核糖体DNA(rDNA)ITS序列测定，具
12、体步骤如下。(1)增菌培养及模板DNA提取：使用沙氏液体培养基对待检菌株进行震荡培养（28，4872h），收获菌丝体以备菌丝提取；使用氯化苄（benzyl chloride）法提取DNA基因组，具体操作方法见参考文献1,2。(2)rDNA-RTS扩增：用真菌通用扩增引物ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）、ITS2(5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3），PCR扩增反应体系体积共25L，其中包括模板DNA 2L(20mg/L),PCR TaqMix 12.5L，上下游引物各0.5L，余体积用灭菌ddH2O补足。PCR反应条件：94预变性2min后，94变性30
13、s,55退火30s,72延伸60s，共35个循环；继而72保持7min延伸。PCR的扩增产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳检测3。(3)序列测定与分析：将扩增出的PCR产物送上海吉美生物医药科技有限公司纯化后进行双向基因测序，测序结果在GenBank(http：/www.ncbi.nlm.nih.gov）基因核酸数据库中进行比对鉴定菌种。1.4、 统计学方法应用SPSS 23.0软件进行统计处理，计数资料比较采用卡方检验。以P0.05为差异有显着性。2、 结果2.1、 皮肤浅部真菌病病种及病原菌分布本文528例病人中前3位浅部真菌病为甲真菌病、足癣、股癣。在分离鉴定的528株菌株中，红色毛癣菌居于
14、首位，其次为须癣毛癣菌、马拉色菌。各菌株分布见表1。2.2、 皮肤癣菌病中主要病原真菌构成情况甲真菌病主要分离出红色毛癣菌（59.09%）、酵母菌（18.94%）；手足癣主要分离出红色毛癣菌（58.50%）、须癣毛癣菌（28.57%）；体股癣主要分离出红色毛癣菌（60.71%）、须癣毛癣菌（20.00%）；头癣的主要病原真菌为犬小孢子菌（83.33%）、红色毛癣菌（16.67%）。见表1。2.3、 病人性别、年龄与浅部真菌病病种的关系在528例病人中，男性305例，女性223例，股癣及体癣男性构成比明显高于女性，差异有显着性（2=33.905、8.705,P0.05）；甲真菌病及足癣女性构成比
15、高于男性（2=22.381、9.488,P0.05）。股癣、马拉色菌毛囊炎病人主要集中在2130岁年龄段，甲真菌病、花斑糠疹以3140岁病人为主，而头癣的发病高峰为10岁（2=6.24515.709,P0.05）。见表2。3、 讨论浅部真菌病是一类常见的真菌感染性疾病，世界范围内人群患病率为20%25%4。随着广谱抗生素、糖皮质激素的广泛应用及人员流动、环境变化，浅部真菌病患（发）病率呈上升态势5，且浅部真菌病致病菌种的构成与分布常表现出地区差异6，也在较长的时间维度下表现出变化7,8。了解本院浅部真菌病病种构成及病原真菌的分布特点，有助于临床工作中对浅部真菌病进行准确诊断和防治。本次研究鉴定的致病真菌以皮肤癣菌为主，其中红色毛癣菌所占比例最大，须癣毛癣菌次之，这与国内部分北方地区报道结果相一致9,10，而上海及杭州等南方地区浅部真菌病的致病真菌以红色毛癣菌和念珠菌为主11，由此可见浅部真菌病病原真菌的分布具有地区差异性。本研究鉴定出的条件致病菌包括汉逊德巴利酵母菌、日本丝酵母菌、暗色真菌及尖端赛多孢子菌
