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1、MTT法检测细胞活性及其应用一、实验目的1.掌握MTT法的基本原理和操作，学会应用MTT法解决简单的实际问题。2.巩固动物细胞培养的知识，熟练相关操作。3.学会酶联免疫检测仪（简称酶标仪）的操作方法。二、实验原理1.MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）三联溶液能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广
2、泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。2.细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。3.从动物机体中取出的相关组织通过胰蛋白酶或胶原蛋白酶可以将其分散成单个细胞。再放于
3、适宜的培养基中，可以使这些细胞生长繁殖以供实验所需。该实验对无菌要求极高，以培养出满足实验条件的细胞。4.酶联免疫检测仪测定的原理是在特定波长下检测被测物的吸光值。酶标仪实质就是一台变相的专用光电比色计或分光光度计。三、实验材料，器材与试剂材料：Hela细胞器材：恒温水浴锅，超净工作台，培养箱（37，5%CO2），冰箱（4、-20、-70），液氮冰箱，灭菌锅，烧杯，培养瓶，滴管，酒精灯，镊子，离心机，24孔培养板，96孔培养板，摇床，酶标仪，倒置显微镜，移液枪（带枪头），15mL离心管,冻存管（1-2mL），红血球计数板，记号笔，0.22m滤膜，铝箔纸。试剂：二甲基亚砜（分析纯），甘油，10%
4、胎牛血清，胰蛋白酶（0.5%），双抗（青霉素，链霉素 1万单位/mL）,磷酸缓冲液（配制见附录1），MTT（ 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。）（配制见附录2），DMEM培养液(配制见附录3)，无菌水，抗肿瘤药物（具体待定）4、 实验步骤A.Hela细胞复苏 1.从液氮容器中取出从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37温水中，并不时摇动令其尽快融化； 2. 从37水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上DEME培养液，混匀； 3. 离心，1000rpm，5min； 4. 弃去上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬
5、细胞，计数，调整细胞密度至1104个/mL，部分接种培养瓶，37培养箱静置培养； 5. 次日更换一次培养液，继续培养，此后定期更换培养液，维持细胞正常活性。B.MTT检测复苏细胞的细胞活性 Hela细胞计数用血细胞计数板的四个角上的方块。 1. 接种培养瓶同时，将其余部分接种于96孔细胞培养板，7组，每组5孔，每孔100L,37培养箱静置培养； 2.培养24h后，向每孔内加入用磷酸缓冲液配制的0.5%MTT（5mg/mL）20uL，37培养箱内培育； 3.4h后终止培养，将孔内培养液小心吸出。每孔加入150L二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。同时每行第一孔设置为调零孔（
6、培养基、MTT、二甲基亚砜）。用酶标仪OD570nm处测量各孔吸光值；C.细胞生长曲线制作 接B.2，B.3步骤，连续测量7天，根据测量结果绘制细胞生长曲线。 横坐标生长时间，纵坐标吸光度值。D.探究某药物对于细胞活性的影响 1.将之前培养于培养瓶中的细胞用0.5%胰蛋白酶洗脱，加入DEME培养液制成细胞密度为1106个/mL的细胞悬液； 2.设置空白对照组及5个不同药物梯度的实验组，分别加载96孔培养板内（5个梯度剂量按药物种类待定），每个剂量分别设置5个平行孔，每孔加入细胞悬液100L（在加药的前一天下午完成铺板）； 3.次日上午按预先设置的药物梯度加药，后置37培养箱培养24h； 4.每
7、孔加入20LMTT溶液，继续培养4h（若药物能与MTT反应，可以先离心后弃去上清液，用PBS冲洗2-3遍后再加入MTT溶液） 5终止培养，小心吸去孔内培养液； 6.每孔加入150L二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，用酶标仪OD490nm处测量各孔的吸光度； 7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。E.Hela细胞冻存 1.配制含10%DMSO或甘油、1020%小牛血清的冻存培养液； 2.取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中； 3
8、.离心1000rpm，5min； 4.去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5106/ml1107/ml； 5.将细胞分装入冻存管中，每管11.5 ml； 6.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 7.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1-2/ min；当温度达-25以下时，可增至-5-10/min；到-100时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20冰箱2h ，然后放入-70冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。五、实验结果 Hela细胞复苏情况良好，生长曲线绘制较好，成功验证肿瘤细胞对Hela细胞的作用。六、附录1.磷酸缓冲液配制方法 NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24g, 调pH 7.4，定容1L2.0.5%MTT溶液配制方法 称取MTT0.5g，溶于100mLPBS中，用0.22m滤膜除菌，放4避光保存。配制和保存过程中，容器最好用铝箔纸包住。3教-学
