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1、黑嘴蒲桃种子超低温保存技术规程1 范围本标准规定了黑嘴蒲桃Syzygium bullockii (Hance) Merr. & L.M. Perry种子超低温保存过程中的术语和定义、种子的选择、种子前处理、种子保存量、种子冷冻方式、恢复培养等技术要求。本标准适用于黑嘴蒲桃种子的超低温长期贮藏。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.6 农作物种子检验规程 水分测定3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1黑嘴蒲桃 Syzygium bu
2、llockii (Hance) Merr. & L.M. Perry为桃金娘科（Myrtaceae）蒲桃属（Syzygium Gaertn.）常绿灌木至小乔木，圆锥花序顶生，多花，植株和番石榴一样带有桃金娘科特有的桉油味。以果实、根入药，用于治疗痨伤咳血、风火牙痛、湿热腹泻、肝炎、风湿痛、胃痛等。收载于中国中药资源志要（1994）。3.2黑嘴蒲桃果实 Syzygium bullockii (Hance) Merr. & L.M. Perry fruits大型果序，浆果或核果状，椭圆形，紫黑色，长约1 cm，宽8 mm。3.3黑嘴蒲桃种子 Syzygium bullockii (Hance) M
3、err. & L.M. Perry seeds黑嘴蒲桃的播种材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子黑褐色，椭圆状卵形，表面光滑。3.4种子超低温保存 seed of cryopreservation 指将经过前处理的黑嘴蒲桃种子置于液氮（-196）中保存。4 种子的选择4.1 果实采收9月至11月，当果皮颜色由绿转为紫黑色时，即可采收，成熟的黑嘴蒲桃成一串串的，口味酸甜，汁多。去除果皮，取出种子。4.2 种子选择挑选发育饱满、均匀、健康的种子，置于4冰箱中保存备用（存放时间不超过3个月）。5 种子前处理5.1 生活力检测参照植物生理学实验指导中的溴麝香草酚蓝（BTB）法测定种子生活力。
4、待测种子在30 35 温水中浸种2 h，随后取吸胀种子50粒，整齐地埋于备好的琼脂凝胶中，注意要将含胚部分埋入凝胶中。将培养皿置于35 温箱中6h后观察结果。5.2 生活力计算在光下用放大镜对染色结果进行观察鉴定。凡种胚周围出现黄色晕圈的种子为有活力的种子，否则为无活力的种子。计算：生活力=有活力的种子数/总的种子数100%待保存的黑嘴蒲桃种子生活力应60%。5.3 含水量范围用尼龙网袋包裹黑嘴蒲桃种子，置于盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为3000:1，室温条件下干燥处理080 h，在干燥过程中定期测定种子含水量，将种子含水量由45%55%降至38%45%。参照GB/T 3543.
5、6中的高恒温烘干法（130烘干1h）测定种子含水量（W0），W0=（鲜重-绝干重）/鲜重100%。6 种子保存量黑嘴蒲桃种子保存量不少于360粒，以便后期的活力检测使用。7 种子冷冻方式黑嘴蒲桃种子超低温保存的冷冻方式为分步冷冻法，即将装有种子和玻璃化保护溶液（PVS2）的15 mL冻存管（每管30粒种子）置于4 冰箱中0.5 h，取出立即放入-20 冰柜中1 h，之后迅速投入液氮中保存。8 恢复培养8.1 种子解冻处理液氮中至少冻存24 h后，取出2个冻存管，立即放入40 水浴中快速解冻3 min，而后用洗涤液（DS）浸泡3次，每次5 min，并用纯净水冲洗干净。8.2 冻后种子生活力检测取
6、出1管解冻后的种子，参照5.15.2生活力检测方法，进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力75%时视为保存成功。8.3 恢复培养将剩下1管解冻后的黑嘴蒲桃种子，播种到带有无菌滤纸的带盖发芽盒中，温度25 30 ，湿度70% 85%条件下培养。附录1 BTB的配制和保存方法精密称取BTB 0.5 g，溶解于煮沸过的500 mL纯水中。滤液若呈黄色，可加数滴氢氧化钠溶液，使之变为蓝色或蓝绿色，随后加入3.5 g琼脂溶解，稍稍冷却即可趁热倒入9 cm 培养皿中，使之成一均匀的薄层，完全冷却后备用。 2 玻璃化溶液（PVS2）的配制及保存方法精密量取甘油23.8 mL、乙二醇13.6 mL、二
7、甲亚砜13.6 mL，称取蔗糖13.7 g，溶于MS溶液中，调pH至5.8后，定容至100 mL，高温高压灭菌，4 冷藏。注意：配置时需戴手套，并在通风厨内操作。3 洗涤液（DS）的配制及保存方法精密称取蔗糖41.1 g溶于MS溶液中，调pH至5.8后定容至100 mL，高温高压灭菌，4 冷藏。参考文献1 中国药材公司. 中国中药资源志要M.北京，科学出版社，19942 中国科学院中国植物志委员会. 中国植物志.第53(1)卷M. 科学出版社, 2004(1984)：0973 Chen Cheih, Lyn A. Craven.Myrtaceae M /Flora Of China Beijing: Science Press/St. Louis: Missouri Botanical Garden Press. 2007. 13: 335-359.4 傅家瑞，宋松泉. 顽拗性种子生物学M. 中国科学文化出版社，2004:15 Reed BM. Plant CryopreservationA Practical GuideM. Springer,2010:34
