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1、 探讨IL-17A在肺纤维化发病机制中的作用 特发性肺纤维化( idiopathic pulmonary fibrosis，IPF) 病因未明、好发于成人、局限于肺部、进行性进展，以寻常型间质性肺炎为病理特征的一种间质性肺疾病。IPF 确诊后的平均生存时间仅仅 2 8 4 2 年。由于其发病机制和病因未明，诊断困难，缺乏有效的治疗和较差的预后，因此，积极探讨 IPF的病因或发病机制，进而寻找有效的治疗手段成为目前学术界研究的重要方向。最新研究表明，白细胞介素 17A( interleukin 17A，IL-17A) 作为一种促炎症细胞因子，参与了慢性炎症过程和自身免疫性疾病。Su 等的研究提示
2、，IL-17A 信号通路中的组分有望成为治疗肺纤维化的新的潜在分子治疗靶点。本实验旨在探讨 IL-17A 在肺纤维化发病机制中的作用，进而为后续探索分子靶向药物治疗 IPF 的新途径奠定坚实的基础。1 材料和方法1 1 材料 清洁级雌性 Wistar 大鼠 20 只，体质量 180 200 g，购自重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司; 戊巴比妥钠为江苏恒瑞医药股份有限公司产品; 博来霉素 A5 为哈尔滨莱博通药业有限公司产品; 兔抗 IL-17 免疫组化试剂盒为北京博奥森生物技术有限公司; IL-17A ELISA 试剂盒为 Bio-ad 公司产品; 总 NA 提取试剂盒为天根生化科技有限公司产
3、品;改良型 PMI1640 培养基、1 高糖 DMEM 培养基、胎牛血清为 HyClone 公司产品; 引物为上海生工生物工程有限公司产品; NA 逆转录试剂盒、PC 试剂盒为成都博瑞克生物技术有限公司产品。1 2 方法1 2 1 肺纤维化动物模型的建立 20 只雌性 Wistar 大鼠随机平均分成对照组即生理盐水( normal saline，NS) 组和模型组即博来霉素( bleomycin，BLM) 组。参照文献4的方法进行造模: BLM 组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠( 40 mg/kg 体质量)进行麻醉，在无菌操作下，钝性分离暴露气管，向 BLM 组大鼠气管注入含 BLM A5( 5 mg
4、/kg 体质量) 的 NS 0 3 mL，迅速将大鼠直立并旋转，使药液在肺内分布均匀。同条件下以相同的方法将同体积 NS 注入 NS 组大鼠气管。1 2 2 肺组织的留取和病理分析 两组实验动物均于气管内灌注 NS 或 BLM 后 7 d 和 28 d 通过右心室采血各处死一半。参照文献5的方法得到肺组织和支气管肺泡灌洗液( bronchoalveolar lavage fluid，BALF) 。左肺注入 40 g/L 的多聚甲醛，并置于 40 g/L 多聚甲醛中固定。取 3 块不同部位的肺组织，石蜡包埋后做成切片，厚度为 5 m，切片使用 HE和 Masson 染色来评价其病理改变( 肺泡炎
5、和肺纤维化) ，具体标准主要参考文献6 7中的方法来确定。1 2 3 肺组织 IL-17 的免疫组化染色 肺组织切片脱蜡、水化、修复抗原、血清封闭; 一抗为兔抗 IL-17 单克隆抗体( mAb) 1100，二抗为 HP 标记的山羊抗兔抗体，DAB 显色、苏木素复染、脱水、透明、封片。对照组用 PBS 代替一抗。利用 Leica 系统对免疫组化染色结果进行图像采集，再利用ImagePro plus 6 0 软件对其进行分析，随机选取 2 个时间点肺组织切片染色区域 5 个高倍视野，计算阳性染色的平均吸光度( A) 值。1 2 4 BALF 细胞计数与分类 参照文献8的方法作细胞数测定，行支气管
6、肺泡灌洗收集 BALF 后取 10 L 细胞悬液充入细胞计数板，用低倍镜计数四角的四个大方格中的细胞数。沉淀细胞涂片，瑞氏染色后行细胞分类，选取 100 个白细胞，按其形态特点进行分类计数，求出各种白细胞所占的百分率，再以细胞总数求得 BALF 中各类白细胞的绝对值。计算公式: 细胞数/L = N/4 10 C 106，其中 N 为 4 个大方格内的白细胞总数，C 为稀释倍数。1 2 5 ELISA 检测 BALF 中 IL-17A 的含量 使用 ELISA 试剂盒对 BALF 中 IL-17A 的浓度进行检测，具体检测步骤按照试剂盒的说明书操作。1 2 6 肺泡巨噬细胞的分离、纯化、培养 行
7、右肺支气管肺泡灌洗收集 BALF，将细胞悬液用含 100 mL/L 小牛血清的PMI1640 培养液在培养瓶中经 37 、50 mL / L CO2的细胞培养箱内孵育纯化 3 h，弃培养液，将贴壁纯化的肺泡巨噬细胞( alveolar macrophage，AM) 再分别用 DMEM 进行培养。两组AM 均采用 6 孔板进行培养，每组 6 个复孔，每孔细胞数为5 105，培养12、24、48 h 后各收集其细胞和培养上清液，备用( 上清液用作 IL-17A 的检测，细胞用作 IL-17A mNA 的检测) 。1 2 7 反转录 PC 检测 AM 中 IL-17A mNA 的表达 从PubMed
8、 数据库中获取大鼠 IL-17A mNA 全序列，IL-17A 引物由上海生工生物工程公司设计和合成，甘油醛-3-磷酸脱氢酶( GAPDH) 作 为 内 参 照。IL-17A ( 188 bp) ，上 游 引 物:5-CTA CCTCAACCGTTCCACT-3， 下 游 引 物: 5-TTCTCAG-GCTCCCTCTTC-3; GAPDH ( 450 bp) ，上游引物: 5-ACCA-CAGTCCATGCCATCAC-3，下游引物: 5-TCCACCACCCTGTT-GCTGTA-3。采用 TIzol 试剂盒提取 AM 总 NA，逆转录反应合成 cDNA，反转录 PC 反应严格按照试剂盒
9、说明书进行，所有样本与 GAPDH 的比值作为 IL-17A mNA 相对表达量。1 2 8 统计学分析 采用 SPSS13 0 软件完成。结果以 x s表示，采用单因素方差分析和 q 检验，所有的比较中，P 0 05表示差异有统计学意义。2 结果2 1 两组大鼠肺组织的病理变化 模型组第 7 天时肺泡腔、肺间质内均可见较多炎症细胞浸润，肺泡间隔增宽，肺间质可见少量胶原纤维组织; 第 28 天时肺泡腔内渗出较少，肺泡结构被破坏，其间隔增宽显着，细胞外基质增生明显，肺间质大量的成纤维细胞也明显增生，大量胶原纤维沉积，形成广泛的纤维化。与NS 组相比，BLM 组第 7 天时肺泡炎较明显，第 28
10、天时肺泡炎减轻，而肺纤维化程度较重( 图1，表1) .2 2 免疫组化检测肺组织 IL-17A 蛋白的表达 NS组大鼠肺组织中IL-17A 呈弱表达，第7 天、28 天表达量无明显变化，分别为 23 67 3 19，24 26 3 35，而BLM 组第 7 天、28 天 IL-17A 表达明显增强，分别为103 48 9 49，87 42 7 64，较 NS 组明显增加，差异有统计学意义( P 0 05) ，而第 28 天表达较第7 天有所降低( 图 2) 。2 3 BALF 中细胞数及细胞类型分析 第 7 天，NS组 BALF 中细胞总数为( 9 45 0 76) 个，BLM 组BALF 细
11、胞总数为( 35 28 2 76) 个; 与 NS 组比较，BLM 组 BALF 细胞总数明显增高，差异有统计学意义( P 0 05) ，第 28 天 NS 组中 BALF 细胞总数为( 9 52 0 67) 个，BLM 组为( 9 71 0 80) 个，两者差异无统计学意义( P 0 05) ; 与 NS 组比较，第7 天，BLM 组 BALF 中 AM 比例较小，中性粒细胞和淋巴细胞百分比均明显增加，差异有统计学意义( P 0 05) ; 第 28 天，BLM 组 BALF 细胞分类百分比，与 NS 组相比无显着性差异( P 0 05，表2) ，表明细胞类型基本恢复正常。2 4 BALF
12、中 IL-17A 的测定 第 7 天、28 天，NS组 BALF 中 IL-17A 分别为( 57 45 6 68) pg/mL、( 5549 606) pg/mL，BLM 组第 7 天、28 天 IL-17A含量高达( 27837 13 99) pg/mL 和( 213 26 11 62)pg / mL，与 NS 组相比，均明显增高，差异有显着统计学意义( P 0 01) ，但第 28 天时 IL-17A 含量较第7 天略有降低，但差异无统计学意义。2 5 AM 培养不同时期上清液中 IL-17A 的浓度变化 BLM 7 d、28 d 组 AM 培养前12 h、24 h、48 h 上清液中
13、IL-17A 的浓度与 NS 组比较，均明显增高，差异有统计学意义( P 0 05，表 3) 。2 6 AM 中 IL-17A mNA 的表达 BLM 7 d 组、28 d 组各时期 AM 中 IL-17A mNA 的表达明显高于NS 组，差异有统计学意义( 图 3、4，P 0 05) ; 尤以前 12 h 显着，24 h、48 h 表达逐渐减弱( 图 5) 。3 讨论目前普遍认为 IPF 的发病机制可能是炎症导致肺泡上皮细胞损伤后，上皮细胞异常增生和再上皮化异 常 修 复 最 终 引 起 肺 纤 维 化。白 介 素 17A( IL-17A) 作为一种重要的促炎症细胞因子，其过度表达容易导致慢
14、性炎症和自身免疫性疾病，而抗IL-17A抗体和抗 IL-17A 抗体通过阻断 IL-17A 或IL-17A 则在强直性脊柱炎、银屑病等多种免疫性疾病中显示出一定的疗效。抗 IL-17A 抗体能否在治疗 IPF 中发挥作用呢? 在本实验中，我们研究了肺纤维化大鼠肺组织炎症情况下 IL-17A 的表达，结果表明，在肺纤维化的发生和发展中，肺组织表达IL-17A 和 AM 分泌 IL-17A 均增加，在肺泡炎阶段更为明显，提示 IL-17A 可能促进了肺泡炎的形成，进而参与了肺纤维化形成。该结果为后续研究靶向治疗 IPF 提供了依据。IL-17A 是 IL-17 家族中重要成员，是重要的促炎症因子。
15、IL-17A 在抵抗某些病原体的入侵以及诱导和维持慢性炎症的过程中发挥了重要的作用。Wilson等研究认为，BLM 诱导的肺纤维化是由 IL-17A 所介导的，而 IL-17A 的致肺纤维化作用则依赖于 TGF-，在气道内大剂量地注射 IL-17A 可以诱导肺纤维化的发生。可见 IL-17A 和其他细胞因子可协同作用于肺纤维化的发生发展。Gasse 等同样发现，BLM 所导致的肺损伤早期 IL-17A 表达增加，并通过基因缺陷小鼠和中和抗体处理小鼠证实 BLM 诱导的早期肺泡炎症需要 IL-17A 和 IL-17A 信号转导通路参与。中和 IL-17A 活性可以改善肺纤维化小鼠肺功能。本实验结果显示，与 NS 组相比，BLM组第 7 天 BALF 细胞总数明显增多，AM 比例明显降低，中性粒细胞及淋巴细胞比例均明显增高; BLM组第 7 天、第 28 天 BALF 和肺组织中 IL-17A 的表达明显升高; 说明 IL-17A 作为炎症细胞因子对中性粒细胞等炎症细胞有较强的趋化聚集作用
