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1、取100ml（根據培養菌體的濃度選擇合適的量，低拷貝推薦用200ml）過夜培養的菌液加入離心管，室溫8，000rpm（8.228*g）離心3min收集細菌，儘量吸除上清。注意：菌液較多時可以通過幾次離心將菌體沉澱收集到一個離心管中，菌液量以能夠充分裂解為佳，菌液過多會導致裂解不充分從而降低質粒的提取效率。儘量吸除上清，為確保上清液全部吸取，請用乾淨的吸水紙吸去瓶壁上的水滴。step01加熱洗脫液TB打開水浴鍋，將溫度設置為65，放入洗脫液TB進行水浴加熱。說明加熱洗脫液是為了增強最後從吸附柱過濾膜中洗脫出質粒的效率。step02加入溶液P1向留有菌體沉澱的離心管中加入8ml溶液P1（請先檢查是
2、否已加入RNaseA，加入RNaseA後的P1溶液須放入4冰箱保存），使用移液器或渦旋振盪器徹底懸浮細菌細胞沉澱。注意請務必徹底懸浮細菌沉澱，如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解效果，導致提取量和純度偏低。對於低拷貝質粒，加大菌體用量的同時按比例增加P1、P2、P4的用量。觀察細菌是否徹底懸浮，可將離心管橫放，看是否有塊狀沉澱。說明溶液P1的成分：50mMol/L 葡萄糖+25mMol/L Tris-Cl(PH8.0)+ 10mMol/L EDTA(PH8.0)（絡合劑）。如果菌泥是-20冰凍保存的，此時混勻較困難，提前加P1，放置20min，恢復至室溫，方便混勻。或者用1ml移液槍槍頭從管壁上
3、刮下來；或者37水浴加熱。混勻的時候，使收集管傾斜，內部的液體會上下滾動，加速混勻，且不容易起泡沫用大槍頭step03加入溶液P2向離心管中加入8ml溶液P2，立即溫和地上下翻轉6-8次，室溫放置5min。注意溫和的混勻，不要劇烈震盪，以免污染基因組DNA。此時菌液應變得清亮粘稠，如果未變得清亮，可能由於菌體過多，裂解不徹底，應減少菌體量。說明溶液P2的成分：0.2N NaOH+1% (m/V)SDSstep04柱平衡步驟（利用此時的5min間隙）向吸附柱CP6中（吸附柱放入50ml收集管中）加入2.5ml的平衡液BL，8，000rpm離心2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中
4、。（用平衡液處理過的柱子最好立即使用；實驗前使用平衡液BL處理吸附柱，可以最大限度啟動矽基質膜，提高效率）。step05加入溶液P405.1向離心管中加入8ml溶液P4，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，至溶液出現白色分散絮狀沉澱。05.2用大槍頭將絮狀沉澱輕柔地貼壁切碎，直至原先整體的白色絮狀沉澱皆成為豆腐渣狀。（使得堿裂解的效果更加充分，獲取的上清更多；離心後沉澱貼壁更牢，也方便離心後的過濾，沉澱不會堵塞篩檢程式）05.3-0室溫放置10min。05.3-1可以考慮利用10min間隙，配好核酸電泳的凝膠。05.412,000rpm（轉速增大，使得沉澱貼壁更牢）離心10min，使白色沉澱
5、離心至管壁。05.5將全部溶液小心倒入過濾器CS1中（,避免倒入大量沉澱而阻塞篩檢程式），慢慢推動推柄過濾，濾液收集在乾淨的50ml的管中（自備，使用滅菌後的50ml離心管，既節省白色收集管還可方便計算上清體積）。注意加入溶液P4後應立即混勻，避免產生局部沉澱。如果離心後倒入篩檢程式CS1中的溶液有白色沉澱也不會影響過濾。如果菌體過多（100ml），推薦延長離心時間至20-30min。說明溶液P4的成分：5mol/L 乙酸鉀+冰乙酸+H2Ostep06加入異丙醇後過柱（分兩次過兩遍）06.1向濾液中加入0.3倍濾液體積的異丙醇（加入異丙醇過多容易導致RNA污染），上下顛倒混勻後靜置2min，再
6、轉移到活化好的吸附柱CP6中開始過柱。說明異丙醇的作用：異丙醇能夠通過-OH的親水作用和水結合，這種親水結合作用的能力比DNA及RNA鏈中的親水基團的結合能力更強，因此原先跟水結合的DNA及RNA就相當於被釋放出來，等同於沉澱。但是相較RNA，DNA鏈中的親水基團結合水的能力更弱，因此加入異丙醇後，首先被“析出沉澱”的是DNA鏈，當此時異丙醇加入過多，那麼RNA鏈也隨之析出，從而導致了RNA的污染，影響品質。注意過濾後濾液會損失，根據損失的不同請加入不同體積的異丙醇，0.3倍體積要嚴格遵循，因50ml離心管刻度精度不夠，因此在估計時要寧可稍微少些而勿多。可先將每管所需加入的異丙醇的體積算好標在
7、離心管上。06.2室溫8,000rpm離心2min，將收集管中的液體再次倒回吸附柱內再次離心2min以增加吸附率；第二遍離心後倒掉收集管中的廢液再倒入剩餘的已加過異丙醇的濾液，再次過柱兩遍。最終棄掉收集管中的廢液後將吸附柱CP6重新放回收集管中。注意因為吸附柱CP6的最大容積只有15ml，而之前所加液體的體積為24ml，所以需要分2次過柱；為了增大吸附質粒的效率，每次過柱之後需要再重新過一遍。step07加入PW（漂洗兩次）07.1向吸附柱CP6中加入10ml漂洗液PW（請先檢查是否已加入無水乙醇），8,000rpm離心2min，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。07.2重複操作步
8、驟07.1。step08加入無水乙醇08.1向吸附柱CP6中加入3ml無水乙醇，室溫8,000rpm離心2min，倒掉廢液。08.2將吸附柱CP6重新放回收集管中，9,000rpm離心5min，目的是將吸附柱中殘餘的漂洗液去除。08.3將離心後的吸附柱CP6轉移到新的收集管中，開蓋晾乾約5min，使得其內殘留的乙醇充分會發乾淨。注意漂洗液中乙醇的殘留會影響後續的酶促反應（酶切、PCR等）實驗。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CP6開蓋，置於室溫放置數分鐘，以徹底晾乾吸附材料中殘餘的漂洗液。step09加入洗脫液收集質粒09.1將吸附柱CP6置於一個乾淨的收集管中，向吸附膜的中間部
9、位懸空加1.2ml洗脫緩衝液TB，室溫放置5min，然後室溫8,000rpm離心2min。09.2第一次離心後再將收集管中的液體倒回吸附柱內靜置2min，室溫12,000rpm離心2min。09.3將收集管中的洗脫液全部移入一個乾淨的1.5ml的EP管，長期保存應置於-20冰箱，以防止DNA降解。注意：為了增加質粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重複步驟13.洗脫液的PH值對於洗脫液有很大影響。若用水做洗脫液應保證其PH值在7.5-8.0範圍內，PH值低於7.0會降低洗脫效率。洗脫緩衝液用量的多少主要是依據質粒的拷貝數以及實驗所需要的濃度來確定。洗脫緩衝液體積不少於1ml，體積過
10、小影響回收效率。可選步驟（如果需要更高濃度的質粒，可進行如下操作）：每1ml洗脫液加入1.42ml異丙醇以及0.42ml 5M NaCl（客戶自備），混勻，室溫放置5min，8,000rpm（8,228*g）離心10min，小心棄上清。加入0.5ml的70%乙醇洗滌沉澱，室溫8,000rpm（8,228*g）離心5min，小心棄乙醇。重複步驟15.空氣中乾燥沉澱約5-10min，根據需要用適當體積的TB緩衝液溶解沉澱。產品簡介 本試劑盒採用獨特的矽膠模吸附技術，高效專一地結合質粒DNA。同時採用特殊的溶液P4和篩檢程式CS1 ,可有效的去除內黴素、蛋白等雜質；整個提取過程僅需1h，方便快捷。使
11、用本試劑盒提取的質粒DNA可適用於各種常規操作，包括酶切、PCR、測序、轉化和轉染多種細胞等實驗。 推薦每次菌液使用量：高拷貝使用量為100ml，得率一般在5001500g左右；低拷貝質粒推薦使用量為200ml，得率一般在200600g左右；低拷貝質粒推薦使用量為200ml，得率一般在200600g左右.注意事項：請務必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項。溶液P1在使用前先加入RNase A（將試劑盒中提供的RNase A全部加入），混勻，置於2-8保存。第一次使用前應按照試劑瓶標籤的說明現在漂洗液PW中加入無水乙醇。使用前先檢查平衡液BL、溶液P2和P4是否出現結晶或者沉澱，如有結晶或者沉澱現
12、象，可在37水浴中加熱幾分鐘，即可恢復澄清。注意不要直接接觸溶液P2和P4，使用後應立即蓋緊蓋子。使用篩檢程式時請將推柄小心緩慢地從過濾管中抽出，避免濾膜因壓力而鬆動。提取的質粒量與細菌培養濃度、質粒拷貝數等因素有關。如果所提質粒為低拷貝質粒或大於10kb的大質粒，應加大菌體使用量，同時按比例增加P1、P2、P4的用量；洗脫緩衝液推薦在6570水浴中預熱。可適當延長吸附和洗脫時間，以提高提取效率。實驗前使用平衡液BL處理吸附柱，可以最大限度啟動矽基質膜，提高得率。用平衡液處理過的柱子最好立即使用，放置時間過長會影響使用效果。質粒DNA濃度及純度檢測 得到的質粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度和純度，OD260值為1相當於50g/ml雙鏈DNA。純化的質粒DNA OD260/OD280通常在1.82.0左右，可直接應用於細胞轉染甚至動物體內試驗等對DNA純度要求很高的實驗中。質粒純化步驟
