1 文献综述1.1咖啡因概述1.1.1咖啡因的来源与消耗咖啡因的英文名Caffeine分别由是由德语Kaffe和法语cafe两个词组成的单词早在1891年德国化学家Friedrich Ferdinand分离出纯咖啡因之前，人们就已经开始以食物和饮料的形式食用咖啡因了[1]咖啡因(caffeine)的化学名称为1，3，7-三甲基黄嘌呤或1，3，7-三甲基-1 H-嘌呤-2，6-二酮-水合物，分子式为C8H10N4O2，分子量为212.21，熔点为235℃-238℃，180℃大量升华成针状结晶结晶性白色粉末，味道微苦咖啡因能溶于水、易溶于80℃以上的热水，甲醇、丙酮、氯仿、吡啶、乙酸乙酯和四氢呋喃，较难溶于乙醚、苯[2]，在272-274 nm处有最大紫外吸收峰[3]咖啡因作为一种植物生物碱，存在于许多植物种类的叶子和果实中[2]，在这些植物中它起着天然杀虫剂的作用，杀死或麻痹以它们为食的昆虫[4]在这些含咖啡因的植物中，大多数研究都是针对咖啡属和山茶花属的植物进行的[5-6]咖啡因、可可碱、茶叶碱等生物碱主要来自植物可可和茶其他不常见来源包括瓜拉那、巴拉圭茶冬青等，可用于含咖啡因的饮料(可乐饮料)中咖啡因的材料来源。
但是，这些植物中的咖啡因含量通常是不同的例如瓜拉那种子中的咖啡因主要存在于果皮(1.6%)和叶片(4.3%)中；茶树中含有2-5%的咖啡因，鲜嫩茶叶比老茶叶中的含量高，夏季茶比春季茶含量高根据干重，在瓜拉那大约含有咖啡因4-7%可可豆大约含有0.03%的咖啡因，可可坚果为1.5%，咖啡豆为1.1-2.2%[7-10]人类摄入咖啡因的途径主要包括每天摄入含咖啡因的食物和饮料（例如巧克力，咖啡，可可，茶，乳制甜点，软饮料），并且咖啡因广泛用作大量处方药或非处方药（例如感冒药）的成分，据报道，现在全世界每年的咖啡因消费量为12万吨，使其成为世界上最普遍的精神活性物质[11-12]据数据统计，世界人均咖啡因消费量约为70毫克/天，其中，约90%的成年人已形成规律消费习惯，日均摄入约227毫克[13]因此，它已被公认为是自然环境中最普遍存在的药物活性化合物（PhAC）之一[14-15]2018年，世界粮农组织预测：2027年世界红茶产量能达440万吨，绿茶产量达到330万吨茶叶产量预期比2015-2017年翻了一番土耳其人均茶叶消费量是世界第一，约为3.16公斤，紧随其后的是爱尔兰(2.19公斤)和英国(1.94公斤)。
而中国人均年消费量为0.56公斤，尚有较大市场潜力这一系列结果表明每人每天平均摄入咖啡因量将增加近一倍1.1.2咖啡因的功能咖啡因具有刺激中枢神经，提高反应灵敏性，增强心脏循环，改善循环功能，紧致肌肤，利尿消肿，抗癌抗病毒等生理和健康作用[22]它是重要的天然生物碱，具有药理活性成分[23]Shi X等人[24]发现，咖啡因可以有效地去除羟基自由基；刘立军等[25]研究人员实验发现，咖啡因对肿瘤的各个阶段具有不同程度的抑制作用此外，咖啡因还对一些肠道微生物（大肠杆菌），肺炎，霍乱和痢疾细菌有相应的抑制作用；作为减肥产品中麻黄碱的替代品[26]根据Rose[32]和其他研究报告，经常摄入咖啡因还可以预防帕金森氏病，减少记忆力丧失和预防老年痴呆症另外，咖啡因还具有外部刺激作用，可用于增强骨骼肌体外收缩力和改善神经肌肉传导的作用，以缩短反应时间和运动时间，从而提高短跑和短距离游泳者的表现[33]咖啡因还能刺激人体的神经系统小剂量可以消除疲劳并刺激神经，改善思维活动，并增强对外界的敏感性如果大剂量长期使用它不仅会导致对人体的成瘾，而且还会对人体产生有害影响[27]过量摄入咖啡因也会导致骨质疏松[28]，抑制DNA修复，抑制某些酶活性，突变，导致孕期胎儿畸形，可能降低生育力等[29-31]。
2015年，研究还证明咖啡因会引起细胞不对称分裂，但并不会影响其子代细胞的染色体分布[34]1.1.3咖啡因所造成的坏境危害在高浓度下，咖啡因对环境中重要的生物转化过程中所涉及的腐生微生物具有毒性，导致环境稳定性紊乱[35]环境中咖啡因的主要来源通常有食用咖啡因的排泄残渣，已过期或不需要的含咖啡因的药物的随意丢弃，植物残枝，医疗垃圾等[36]而含有咖啡因的食品工业大规模生产，使得茶叶废渣和可可、咖啡豆浆果等废弃物剧增由于咖啡因难以降解，现已被视为一种环境污染物因此，大量含有咖啡因的食品工业废料也相继带来了许多环境污染问题而咖啡因又是一种既具有亲水性又具有亲脂性的物质，当被施用于人类或动物时，咖啡因可以分布在所有体液中并穿过所有生物膜[37]摄入后，大约1–10%的咖啡因被人体代谢后从尿液中排出排出的咖啡因随后会到达废水处理厂（WWTP），然后进入水循环[38]由于据报道环境中咖啡因的残留浓度很高，因此咖啡因残留物对生态安全和人类健康的潜在不利影响引起了人们的极大关注但是，目前尚无规范的方法来估计咖啡因对野生生物的不利影响在中国市场上，高纯度的咖啡因是国家规定管制的二类精神药品，但咖啡因天然的广泛存在于100多种植物中，如可可、咖啡豆、苏丹可乐果中[23]。
随着农产品工业的迅猛发展，茶叶、可可、咖啡豆种植，加工环节产生的废弃物的数量也随之大量增加[39]咖啡因作为一种工业废弃物的污染物，因其溶于水，能在周围水体中释放，现已在地下水[41]、地表水[42]中检测到咖啡因作为与人类活动密切相关的新兴污染物，环境中的咖啡因可作为人为污染的指标，也是地表水中废水的特定来源指标[15,36,43]因此，在废水样品中观察到了咖啡因残留物的较高浓度和检测频率例如，在新加坡，废水中咖啡因的最高浓度高达3594 μg/L[44]有研究表明，一些水生生物在含有咖啡因的水体中会出现生长发育异常[45]此外，高浓度的咖啡因对腐生生物具有毒害作用[46]，还对许多昆虫[47]、草本植物[48]具有生长抑制作用甚至，咖啡因还会降低土壤肥力，抑制种子幼苗的萌发与生长[49]因此，消除食品工业生产和环境中的咖啡因污染，对促进人类健康和社会效益的提高具有重大意义[50]脱咖啡因技术，已成为当今乃至未来食品加工与环境研究领域中一个不容忽视且亟待解决的重要课题图1-1 咖啡因的主要来源，污染和危害Fig.1-1 The main sources, pollution and harm of caffeine 1.1.4脱咖啡因技术迄今为止，国内外科研工作者对脱咖啡因技术进行了很多的研究，其中因很多人喜茶却不耐受咖啡因，故大多数研究集中于茶产业的脱咖啡因技术[51]。
迄今为止，咖啡因脱除技术主要包括物理化学吸附分离法、溶剂萃取法、超临界二氧化碳萃取法以及新兴的微生物酶降解法等[52]这些方法各有利弊，适用范围不同：咖啡因可溶于某些有机溶剂，通过溶剂萃取法使用二氯甲烷和氯仿去除咖啡因[53]该方法简单且去除效率高，但所用溶剂有毒且易于残留后续处理不当会严重的环境污染，因此该法已在生产中逐步取消利用材料特性的差异通过物理化学吸附分离法开发的脱咖啡因技术[54]具有去除选择性好，效率高的特点，但树脂价格高，使用寿命不长，能耗高，在大型食品工业脱咖啡因生产中不适用新兴的超临界CO2提取方法可以高选择性地提取咖啡因，无毒，安全，工艺简单但是，这种技术设备需要大量投资和较高的运行成本[54]，也不适用于食品工业脱咖啡因以及废弃物咖啡因的处理微生物酶降解法是通过耐较高浓度咖啡因的微生物产生的特异性酶来降解咖啡因的方法上个世纪70年代，研究表明：咖啡因对微生物有毒1970年代初，首次报道了咖啡因的微生物降解[55]咖啡因在微生物细胞中降解的相关酶学和生物化学已经得到了很好的研究[21]室内培养基培养中发现，当咖啡因浓度高于0.0025 g / mL时，它可以抑制许多细菌的生长[56]。
当将含咖啡因的介质添加到抗菌剂（如氯霉素）中时，观察到一定的协同作用从那以后，关于利用咖啡因的微生物的生长的研究取得了进展[55-58]微生物降解法是一种新兴的脱咖啡因技术该技术优势为：条件温和、设备简单、选择性好，因而具有良好的开发潜力和市场前景[59-60]研究者试图利用咖啡浆作为动物饲料来源已经从经济的角度做到了环境的角度因此，去除抗营养成分，如咖啡因，成为必不可少的工序[61]而微生物脱咖啡因的技术相比较于物理和化学技术更温和，更简单，也更清洁Mazzafera(2002)和Hakil(1999)等人分离出了相当数量的细菌，这些细菌能够利用咖啡因作为碳和氮的唯一来源，这些细菌可能是生物脱咖啡因的目标[19,62]咖啡因降解途径中产生的黄嘌呤类生物碱，同咖啡因一样，有经济价值，有功效用途因此，微生物对咖啡因的降解不仅成为克服环境问题的重要手段，而且可以作为其他重要商业产品[61]的回收方法正因为如此，微生物脱咖啡因在一般环境和医学领域具有重要意义[63]近年来，许多关于微生物对咖啡因生物降解的研究报道表明，生物转化咖啡因已成为一项全球性的议程[29]1.2咖啡因与微生物的关系1.2.1耐咖啡因的微生物早在上世界60年代，C. V. Sundar Raj等科研工作者就发现咖啡因具有抑菌作用。
近年来的研究中，许多科研工作者针对咖啡因抑菌及其效果进行了详细研究2004年，严赞开等人[64]结果表明：7种不同浓度的咖啡因（0.07%，0.09%，0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%）对五种被测细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、汉逊式酵母、青霉菌）的生长具有较强的抑制作用，其最佳抑菌浓度为0.3%-0.7%PH值和温度也影响咖啡因对细菌的抑制作用2006年，Almeida等研究表明，沙雷氏菌会被咖啡因抑制生长[65]2007年的研究表明，咖啡因可抑制黑曲霉菌丝的放射状生长，菌丝的产生和分生孢子的萌发随着咖啡因浓度的增加，抑制作用增强[66]2010年，戚丽和张华艳等发现，咖啡因的浓度为10 mg/ mL时，对茶树常见的病原菌（茶树云纹叶枯病、轮斑病、赤叶斑病和炭疽病）具有显着的抑菌作用，证明咖啡因在体外具有很强的抗菌作用[67]2013年，Kim等人研究发现绿茶提取物中的咖啡因可以抑制白色念珠菌[68]咖啡因对水霉科菌的生长具有很强的抑制作用，浓度为0.2％时，生长完全抑制[69]，它也对粘质沙雷氏菌，肠杆菌科和匍枝根霉的生长具有抑制作用[70-71]国内外研究表明，咖啡因对一些微生物的确具有生长抑制，因而具有抗菌作用。
此外，咖啡因还不同程度地抑制口腔微生物的生长[72]此外，研究表明，咖啡因的抑菌作用与其浓度呈正相关，低浓度咖啡因仅能短期抑菌，而高浓度咖啡因能强而持久的抑菌作用[73]已知咖啡因在较低的浓度水平下会对不同生物产生多种生理作用，最显著的作用是抑制磷酸二酯酶，从而导致细胞内cAMP水平增加，对细胞内钙水平的影响以及腺苷受体的拮抗作用[74]对于微生物，低浓度咖啡因也具有抗菌性添加了咖啡因的情况下，细菌菌株（如大肠杆菌和其他细菌菌株）的生长收到抑制[75]这可以归因于对大肠杆菌的研究发现，其中咖啡因通过抑制胸苷激酶抑制了DNA的合成，而胸苷激酶又抑制了胸苷向DNA的掺入，并损害了RNA[76]咖啡因可增强某些抗菌剂（如青霉素，四环素）对金黄色葡萄球菌的抑制作用[77]和呋喃唑酮对弧菌的抑制作用[78]Sundarraj和Dhala[79]研究了咖啡因和其他相关甲基黄嘌呤对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的影响结果发现：高浓度咖啡因具有杀菌作用，而较低浓度下则具有抑菌作用注意到咖啡因影响大肠杆菌的吲哚合成和乳糖发酵，其作用只是暂时的浓度为1 g/L的咖啡因对任何测试生物均无影响因此，可以假设降解咖啡因的细菌菌株具有耐受高浓度咖啡因的能力，这是由于专门的蛋白质和大分子可以防止咖啡因引起的细胞损伤。