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1、侵袭性真菌药敏试验操作标准,王 瑶 北京协和医院检验科 2015年3月8日,1,真菌药敏试验操作,真菌药敏试验指南,CLSI M27-A3酵母菌肉汤稀释法 M27-S4 QC & BPs M38-A2丝状真菌肉汤稀释 法 M44-A2酵母菌纸片扩散法 M44-S3 QC & BPs M51-A丝状真菌纸片扩散 法 M51-S1 QC & ECVs,EUCAST,E.DEF 7.2 酵母菌肉汤稀释 法 E.DEF 9.1 产孢丝状真菌肉 汤稀释法 真菌临床折点V6.1,2,2,真菌药敏试验操作,微量肉汤稀释法-酵母菌,3,真菌药敏试验操作,酵母菌肉汤稀释法CLSI M27-A3,培养基：RPMI
2、 1640, 0.165mol/L MOPS, pH 7.00.1 菌株传代：沙保弱培养基(SDA)或土豆培养基 (PDA)，35，念珠菌24h，隐球菌48h 接种量：5.01022.5103CFU/ml 孵育条件：35，非新型隐球菌2448h；新型隐 球菌7074h,4,真菌药敏试验操作,CLSI M27-A3酵母菌 微量肉汤稀释法判读时间和标准,5,两性霉素B：24或48h，100%抑制 氟康唑、伏立康唑(M27-S4)： 24h，50%抑制；如 生长对照生长不充分，则48h判读 伊曲康唑、雷伏康唑、泊沙康唑：48h，50%抑制 5-氟胞嘧啶：48h，50%抑制 棘白菌素类：24h，50%
3、抑制 不能24h读取结果的药物，是由于其折点按照48h 结果制订，或其24hMIC结果没有完成临床应用评 估,真菌药敏试验操作,CLSI M27-A3酵母菌24h与48h读取区别,大部分酵母菌MIC在24h和48h区别很小 部分菌株，24h MIC结果与临床相关性更好 氟康唑：约5%菌株在48h产生严重拖尾现象， 使24h敏感株在48h变为耐药，动物实验表明这 些菌株体内敏感。 棘白菌素类折点按24h结果制订 CLSI 提供了24h和48h质控范围,6,6,真菌药敏试验操作,商品化试剂盒ATB Fungus 3 改良微量肉汤稀释法,选取培养时间不超过4天的纯培养菌落，如培养物不纯应 进行分纯后
4、检测 制备2McF菌液 将20l菌悬液加入ATB F2培养基的安瓿中 用无菌吸管轻轻吹吸混均，尽量避免产生气泡 在每个杯状凹槽中加入135l混匀的ATB F2培养基 35 2环境中，念珠菌属培养24h 2h，新型隐球菌培 养48 h 6 h ATB Fungus 3操作视频 .mov,7,真菌药敏试验操作,ATB Fungus 3判读规则,8,与生长对照相比 生长不减少4分 生长稍减少3分 生长明显减少2分 很微弱生长或管壁周围生长=1分 不生长0分 唑类药敏易出现拖尾，机读易产生假耐药结果， 应进行人工较正 ATB Fungus 3结果展示 .mov,真菌药敏试验操作,商品化试剂盒- Yea
5、stOne 色原度物法MIC判读,加入Alamar蓝 蓝色（阴性） 红色（阳性,两性霉素B 其它药物,9,POS,真菌药敏试验操作,微量肉汤稀释法丝状真菌,10,真菌药敏试验操作,丝状真菌肉汤稀释法CLSI M38-A2,11,11,真菌药敏试验操作,非皮肤丝状真菌孢子菌悬液的制备,接种物：分生孢子或孢囊孢子菌悬液0.41045104 CFU/ml，重复性好 诱导产孢：大部分霉菌PDA培养基352C 7d或至产孢良好，毛霉 和曲霉48h，镰刀菌属352C 4872h然后28302C培养到第7天 。 1ml 0.85%盐水，可加入1滴or0.01ml吐温20，尽量去除菌丝片段。 静置35min，
6、取上清转移至无菌管，振荡15s（注意气溶胶） 使用光线路径1cm比色杯，测定530nm光密度： 曲霉、拟青霉0.090.13， 镰刀菌、毛霉、波氏假阿什利霉、多育赛多孢0.150.17， 链格孢、离蠕孢0.250.3 悬液1:50稀释，达到最终要求浓度的2倍,12,真菌药敏试验操作,CLSI M38-A2丝状真菌肉汤稀释法,13,13,真菌药敏试验操作,CLSI M38-A2棘白菌素类MEC判读,最低有效浓度（MEC）：棘白菌素-曲霉 与不含药物的生长对照相比，能够导致菌丝形 成小的、圆形的、紧凑的菌丝颗粒的最低药物 浓度,MEC,异常的,14,真菌药敏试验操作,卡泊芬净MEC判读,生长对照,
7、黑曲霉 黄曲霉 土曲霉 烟曲霉,15,真菌药敏试验操作,浓度梯度稀释法-ETEST,16,真菌药敏试验操作,酵母菌Etest药敏试验方法,17,酵母菌Etest操作视频.mov,17,真菌药敏试验操作,念珠菌Etest判读,100%抑制,酵母菌Etest结果展示 .mov,80%抑制,18,真菌药敏试验操作,丝状真菌Etest方法,19,曲霉 Etest操作视频.mov,真菌药敏试验操作,烟曲霉Etest结果判读,100%抑制 80%抑制,20,真菌药敏试验操作,纸片扩散法,21,真菌药敏试验操作,CLSI M44-A2酵母菌纸片扩散法,纸片扩散法适用于水溶性抗菌药物，如氟 康唑、伏立康唑 原
8、理： 含有定量抗菌药物的纸片 0.5%甲基美蓝+2%葡萄糖M-H琼脂平板 药物在纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度,22,22,真菌药敏试验操作,CLSI M44-A2酵母菌纸片扩散法,23,23,真菌药敏试验操作,CLSI M44-A2酵母菌纸片扩散法,读取抑菌环直径mm 除两性B读取100%抑 制，其它药物读取明 显抑制处 在抑菌环内个别细小 或等大小的菌落， 可忽略不计,24,真菌药敏试验操作,CLSI M51-A丝状真菌纸片扩散法,25,适于侵袭性感染丝状真菌 链格孢属、曲霉属、镰刀菌属、拟青霉属、根 霉属及其它接合菌、波氏假阿什利霉、多育赛 多孢等 不适于皮肤丝状真菌 不适于双向真菌
9、 无临床折点，仅有ECV,真菌药敏试验操作,CLSI M51-A丝状真菌纸片扩散法,26,培养基：不补充钙、镁的MH培养基，pH7.27.4 接种物：分生孢子或孢囊孢子菌悬液0.41065106 CFU/ml，重复性好 诱导产孢：大部分霉菌PDA培养基352C 7d或至产孢良好，毛霉 和曲霉48h，镰刀菌属352C 4872h然后28302C培养到第7天 。 1ml 0.85%盐水，可加入1滴or0.01ml吐温20，尽管去除菌丝片段。 静置35min，取上清转移至无菌管，振荡15s（注意气溶胶） 使用光线路径1cm比色杯，测定530nm光密度：曲霉、拟青霉 0.090.13，镰刀菌、毛霉、波
10、氏假阿什利霉、多育赛多孢 0.150.17，链格孢、离蠕孢0.250.3,真菌药敏试验操作,CLSI M51-A丝状真菌纸片扩散法,27,孵育时间：到生长良好 毛霉1624h； 黄曲、黑曲、烟曲24h，其它曲霉48h； 链格孢、离蠕孢、拟青霉、波氏假阿什利霉、 多育赛多孢4872h 除两性霉素B外，判读80%抑制，抑菌圈内 轻度拖属或有菌丝长入抑菌圈，均可忽略,真菌药敏试验操作,CLSI M51-A丝状真菌纸片扩散法,黄曲霉,28,真菌药敏试验操作,小结,选择适合的药敏试验方法后，认真研究相应指南,或产品说明书的操作要求，严格执行！ 注意培养物孵育时间 注意不同菌属接种量 注意不同菌属药敏孵育时间 注意不同药物采用不同检测方法时的判读标准 严格质控，质控株检测结果也是培训判读标准的 好教材！ 切勿想当然操作，做错不如不做,29,真菌药敏试验操作,Thanks,PEKING UNION MEDICAL COLLEGE HOSPITAL PEKING UNION MEDICAL COLLEGE HOSPITAL,30,真菌药敏试验操作
