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1、（一）筛选结果鉴定：（1）基因组DNA提取PCR鉴定外源基因（2）SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹鉴定P16蛋白表达（Western-blot）。（3）测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3单细胞悬液70%酒精固定裂解细胞核糖核酸酶消化碘化丙啶染色上机分析G1期和G2/M、S期比例。细胞生长曲线测定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA35104/孔接种24孔培养板24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞计算细胞生长抑制百分
2、率。软琼脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3104 细胞0.3%低熔点琼脂糖培养1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数计算克隆形成率抑制率。三、注意事项1、 优化转染条件（脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间）每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸应高度纯化。为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下，这是细胞惯常的做法。但是，脂质体以及脂质体/ DNA混合物无需滤过除菌。2、 预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。但是在随后的脂质体/ DNA与被转染细胞共孵育的过程中，血清又是培养基的一
3、部分。3、 在转染之前更换培养基，可提高转染效率，但所用培养基必须37预温。4、 脂质体/ DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。常见问题和解答：Q：我觉得套环法操作不如96孔办法效率高。A：也不一定.依据实验目的与要求而定. 如果克隆效率较低的细胞,套环可能更好.用96孔板法,如果不是每孔单个细胞,就不能保证是单克隆.即使是增加到每孔十几个细胞或上百个,一个96孔板也只能培养一万个细胞,十万个细胞就至少需要10个板,100万个细胞就需要100个板,对于转基因细胞筛选或基因打靶,工作量就太大了.且细胞在单独生长条件下
4、,远远不如千万个细胞共同培养活力好. 因此还得看这位朋友使用的是什么细胞,有限细胞系还是无限细胞系,转基因还是非转基因,筛选还是不筛选,需要的单细胞克隆株数量多少?Q：请问一种细胞如果转染了稳定表达的，含neo抗性基因的质粒后，如何用G418筛选？我查看了国内、外50几篇文献后发现没有一个定论的说法。即使对于同一种细胞其筛选剂量和筛选时间也不一样。我自己认为，从理论上讲，如果稳定表达最好要一直筛选到细胞传代后。不知这种观点对不对。然而开始筛选的剂量、维持剂量以及筛选持续时间又该如何确定？维持剂量与开始筛选时的剂量是否有一定关系？A：1. G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000
5、cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml等2个级别, 培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。 。我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有G418，很快会形成优势的。 。即是有G418抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重要的。Q：请问：能谈一谈单克隆化操作的步骤以及其与目的基因表达的关系吗？A：转染后，每个细胞内目的
6、基因与宿主染色体的整合状况是不同的，目的蛋白表达有的多，有的少，外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小，所以生长较快，在生长若干代之后，表达少的细胞会形成优势，长期之后，表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要，转绿色荧光蛋白基因后，表达越来越暗就是这个道理。所以，要进行单克隆化操作，使得到的均来自于同一祖先细胞，遗传性状尽量一致，也是对高表达细胞的保护。操作用96孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留cell左右就可以进行该操作了，该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述，我就不赘述了。必须指出，单克隆化要做几遍，一遍是不够的，我前十代都是这样的，结果绿色荧光蛋白不但没减弱，反而增强了很
7、多。现在很多代了，很稳定。Q：1。我的质粒中含有SV40与neo基因，好像就不存在外源蛋白表达少的细胞形成优势这个问题了吧。 2。按您的讲法，筛选要进行10代，那么维持剂量要进行多长时间？如果我使用对照组,在对照组细胞全部死亡后就用维持剂量进行培养行吗？ 3。在细胞用胰酶进行传代时，此时细胞膜受到一定影响，如果培养基中存在G418对细胞是否有影响？ 4。既然细胞表达neo,从理论上讲是否无论多大浓度的G418对之都无影响？A：1.可以肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的，这点我们做过FISH验证过，表达量与整合数目，上游序列特性，特定部位DNA立体结构都是相关的，装
8、入了SV40只是增加了表达了数目，但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法，转染完GFP的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。neo基因也是这样，而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同，不同细胞同一基因的数目也不会相同，这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。有时，neo表达了，但目的基因丢失了的情况也是有的。 。那为什么还要筛选基因？是这样，用概率论的思维来理解，某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因，那么，一种基因拷贝数为0的可能性，及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小，很大的概率为外源基因的不均质。打个比方，一个大口袋，抓个红球，再抓100个黄球，然后以从中抓若干个，这些球均为
9、红球的概率有多大呢？应该是很小的。红球就是neo，黄球就是你的目的基因。我们用neo，实际上是筛选的外源基因整合的数目，怎么说呢？用刚才的例子来说，如果我们抓着个红球，另一次抓着个红球，可以肯定，的二次抓的球比较多，那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。维持就是只要养这种细胞，就要维持。可以再低些，但不能没有。或者隔一定时间从新使用筛选量压一下，我不知你是否干临床，想想抗生素的用药原则，反向思维一下，实际上我们在筛选耐药株呀。 。neo的产物是酶，过高的G浓度就要有更多的neo酶来支持，否则细胞也要被毒死的，而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担，细胞可
10、能因此无法完成分裂与增殖，我们曾试过，即使在同一转染阳性细胞，在不同浓度的G418液中生长速度也不同，严重形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛，这回不用数论的，用米氏方程理解吧。 。胰酶的作用不必理会，有的细胞受影响，还有的细胞不受影响，由几代之后，不受影响的细胞会占优势的。 仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理，实在是个人经验，而且在基础科学领域顶多算票友，我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。Another answer:1.外源基因整合后的基因表达量与整合的位置高度相关，如果整合发生在活性转录染色质区，则有利于表达。通常用的载体是靠非同源重组随机整合的，所以为了获得高表达细胞株，需要对重组克隆进行筛选。某些载体如pcDNA3包含SV40的复制起始位点，可以是质粒在反式提供大T抗原的细胞系中复制，增强瞬时表达，有利于提高质粒的随机整合几率。对普通的表达载体来说，即使抗性基因表达也无法保证外源基因的整合，表达载体随机整合的结果常常导致目的基因的损坏甚至丢失。 。关于概率论的思维，我认为红球和黄球的比喻很形象，但未必准确。因为抗性基因和目的基因有一定的联锁，并不是完全相互独立的。
