《Cx43及其半通道与缺氧缺血性乳鼠脑损伤的相关性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Cx43及其半通道与缺氧缺血性乳鼠脑损伤的相关性研究（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Cx43 及其半通道与缺氧缺血性乳鼠脑损伤的相关性研究1 研究背景新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxicischemia brain injury,HIBI)仍然是婴幼儿急性死亡率和慢性发病率的重要原因 , 据估计缺氧缺血脑损伤的发生在发达国家大约是每 1000名出生的足月新生儿中有大约 2-4 名, 发展中国家是其 20-30 倍, 甚至更高。此外 25%的会出现严重的 , 永久性神经心理后遗症 , 包括如智力落后、视觉运动障碍、视觉感觉障碍、多动、脑瘫、癫痫等。尽管新生儿医疗保健不断发展 ,HIBI 病理生理机制的研究在不断增加 , 但缺氧缺血仍持续导致显著的长期神经功能障碍或死亡。 出生
2、窒息的新生儿每年估计约 1 百万或占全世界新生儿死亡的 23%。HIBI 是一个渐进的过程 , 大量的证据显示不成熟和成熟脑组织对脑损伤的病理和后果存在明显不同。神经元之间的连接以突触为主 , 而胶质细胞之间多通过缝隙连接 (gapjunction,GJ) 进行信息的传递 , 其中星型胶质细胞通过 GJ高度联系的 , 允许细胞外 K+、H+、谷氨酸和其他物质的空间缓冲。星型胶质细胞表达的连接蛋白 43(connexin,Cx43) 及其半通道 (hemichannel,HCl) 在神经系统疾病中得到越来越多的探索 , 为我们研究 HIBI 的发病机制和治疗带来新的视野方向。与神经元相比 , 星
3、型胶质细胞组成了脑内细胞的种群 , 能够表达最高数量的缝隙连接蛋白 , 称为连接蛋白 (connexin,CX) 。由连接蛋白组成的六聚体结构 , 称为连接子。由同种连接蛋白组成的连接子为同聚体连接子 , 不同种连接子组成异聚体连接子。相邻的细胞膜对应面上的一对连接子组成缝隙连接通道。同聚体连接子构成同型缝隙连接, 异聚体连接子参与构成异型缝隙连接。连接蛋白是跨膜蛋白 , 形成细胞间两种不同的通讯途径。一种途径涉及缝隙连接通道 (gap junction channel,GJC)定位于相邻细胞之间 , 允许直接的细胞与细胞间离子和小分子的传递。另一种途径是通过半通道定位于非对向的细胞面 , 允
4、许细胞内和细胞外区域的交换 , 包括自分泌或旁分泌信号分子 ( 例如 ,ATP,NAD1, 和谷氨酸 ) 到细胞外介质。目前在哺乳动物中已发现 CX家族有至少 21 个成员 , 根据 CX分子量的不同而命名 ; 根据基因序列同源性程度和胞浆内环状结构域长度的不同可分为不同的亚类, 即、 、及 类。Cx43属于 -CX亚族 , 分子质量 43kD,Cx43在脑组织中表达最强 , 星形胶质细胞、活化的小胶质细胞、 处于发育阶段的神经元、 血管平滑肌和血管内皮细胞上都有分布。多年来一直认为半通道是缝隙连接的一半 , 不能够独立发挥作用。近些年通过几种试验方法证实半通道能够独立存在。 冷冻断裂复制非洲
5、爪蟾蜍卵母细胞胞浆表达 Cx50, 展示一种新的膜内粒子群 ( 直径约 9nm)与全细胞电流有关。使用抗 Cx26抗体与 Cx26 C端的区域发生反应 , 免疫荧光发现 Cx26定位于一种硬骨鱼水平细胞树突尖端 , 此处缝隙连接是缺乏的 , 暗示 Cx26 可能形成半通道。应用促炎症试剂处理人类多形核细胞 , 不是静止细胞 , 通过免疫荧光使用抗体直接作用于 Cx43 细胞外环 1, 发现了 Cx43 半通道的存在。通过生物素化细胞表面蛋白的蛋白印迹发现骨细胞 MLO-Y4的表面存在一定水平 Cx43。Cx43 半通道的一部分在休息状态时能开放 , 有一定的生理作用 , 当在病理环境下变得更加
6、活跃 , 导致胶质递质 (ATP, 谷氨酸 ) 的释放 ,Ca2+、葡萄糖的进入 , 离子的失衡 , 细胞容积的超载 , 甚至在一些情况下 , 出现细胞死亡。连接蛋白调节通道功能 , 是动态性和代谢相互作用所必需的 , 这种相互作用是星型胶质细胞建立与自身和他们界面上神经元与脉管系统之间的作用。 事实上 , 在转基因动物中 , 有 2 个主要的星型胶质细胞性连接蛋白 , 如 Cx43和 Cx30被删除 , 展现出钾清除 , 突触传递和可塑性受损 , 一种髓鞘形成障碍性表型及血脑屏障完整性丢失。目前为止 , 使用单 Cx 基因敲除鼠能提供关键资料证实在神经元迁移中Cx43的作用。在中风 , 以前
7、的研究提到星型胶质细胞一个可能的作用是扩大损伤。事实上 , 他们是主要防御兴奋性细胞毒性, 通过积极清除谷氨酸。然而, 能量耗竭能够逆转转运 , 随后导致谷氨酸转运体GLT-1 的下调 , 加剧兴奋性细胞毒性。在组织的应激下 , 星型胶质细胞能够通过GJC播散凋亡信号和 HCl 信号。在代谢抑制剂诱导的应激下 , 星型胶质细胞连接蛋白HCl 活性增强加剧细胞死亡。在一个体内创伤模型中 , 损伤后 24-72 小时 , 同侧海马中发现增强的Cx43 免疫活性 , 创伤后 1 小时也检测到磷酸化的Cx43。在海马薄片中 , 连接蛋白为基础的通道阻滞剂 , 甘草次酸和辛醇显著降低创伤后细胞死亡。来自
8、Cx43 KO鼠的脑组织薄片 , 对 Cx43 使用反义寡核苷酸也观察到类似的结果。在脊髓损伤的研究提过药示 Cx43 半通道在损伤早期参与。在细胞划痕试验中 , 细胞在距离划痕约 17 mm能获得 Cx43 半通道调控通讯 , 并没有 GJC依赖的偶联变化。半通道活性的增加是与擦伤后 24 小时凋亡细胞增加有关 , 能够被连接蛋白半通道的抑制剂废除。Cx43 在脉络丛上皮细胞摄取铅的过程所起的作用 , 结果显示 , 通过降低血清条件激活Cx43 半通道 , 能够引起铅浓度的增加。 Cx43诱导铅摄取能够被Cx43半通道阻滞剂生胃酮阻断后降低。这些数据确立铅在血脑屏障能够积累, 证实 Cx43
9、 半通道在铅摄取中的作用以及它受 Erk 磷酸化的调节。多项研究发现脑损伤后星形胶质细胞可表达caspase, 其表达量与凋亡指数呈正比 , 提示亦与神经胶质细胞调亡有关。在脑缺血时 , 半胱天冬酶级联反应受 caspase-3 的特异性调节。活化的 caspase-3 刺激线粒体途径引起凋亡 , 被认为是神经元凋亡和脑损伤程度的生物标志物。活化的 caspase-3 能够执行细胞程序性死亡 , 移除不必要的神经元。在新生脑损伤模型中 , 药物抑制凋亡能降低损伤 , 改善运动感觉功能。 2 研究目的 (1) 通过新生儿鼠缺氧缺血模型确定 Cx43 及半通道是否在未成熟脑组织中表达 ;(2) 动
10、态观察体内缺氧缺血后及葡萄糖氧剥夺后 Cx43、半通道及 caspase-3 的变化 , 以及星型胶质细胞活性的改变 , 为寻求 HIBI 的发病机制及治疗方法提供新的理论基础。3材料与方法 3.1 实验对象 (1) 新生 7 日龄 Wistar 大鼠共 80 只, 体重 12-17g, 平均体重 (14 2.8)g, 大鼠雌雄不限 , 由山东大学实验动物中心提供。(2) 人类大脑皮层星型胶质细胞株 : 购自美国 ScienCell 研究实验室 3.2 研究对象分组及模型制备 :(1) 实验动物分组 : 健康新生 Wistar 大鼠 80 只,7 日龄 , 随机分为 5 组, 即假手术组 (S
11、ham组) 、缺氧缺血后 1h 组 (T1h 组) 、缺氧缺血后 12h组 (T12h 组 ), 缺氧缺血后 24h 组(T24h 组), 缺氧缺血后 48h 组(T 48h 组) 。(2) 动物模型制备 :7 日龄新生 Wistar 鼠用利多卡因颈部皮肤局部麻醉后 , 胶布固定乳鼠四肢及头部于操作台面上 , 剪开颈部正中皮肤 , 分离皮下脂肪 , 于胸锁乳突肌内侧的深部分离左颈总动脉 , 用 5-0 丝线结扎两端并剪断血管 , 术中用棉球止血 ,3-0 丝线间断缝合皮肤切口 , 整个手术约 5 分钟 , 假手术组仅给予分离左颈总动脉后 , 缝合皮肤。术后 2 小时 , 持续充以 8%氧氮混合
12、气体 , 气流量约 1 L/min,维持 3 h, 术后放回母鼠身边喂养。动物实验室温度设定为231, 房间固定湿度为 60% 10%,12 小时照明 ,12 小时黑暗。3.3 HE 染色对假手术组 , 缺氧缺血后 1 小时组 , 缺氧缺血后 12 小时组 , 缺氧缺血后 24 小时组及缺氧缺血后48 小时组乳鼠脑组织行HE染色。 3.4 免疫荧光双标记法利用免疫荧光双标记法检测缺氧缺血后1 小时组乳鼠脑组织中Cx43 +GFAP,HCl + GFAP的表达。 3.5 免疫荧光组织化学法利用免疫荧光组织化学法检测假手术组及缺氧缺血后不同时间点各组乳鼠脑组织中Cx43、Cx43-hemichan
13、nel和 Caspase-3的表达。 3.6 免疫印迹法采用免疫印迹法测定假手术组及缺氧缺血后不同时间点各组乳鼠脑组织中Cx43、 Cx43-hemichannel和 Caspase-3 的蛋白含量。3.7 细胞培养和转染人类大脑皮层星形胶质细胞细胞株购自ScienCell研究实验室 , 用 Cx43-特异性 shRNA进行转染 ,shRNA星形胶质细胞 , 由 W.H.Moolenaar馈赠 , 序列为 :GGTGTGGCTGTCAGTGCTC;Psup星形胶质细胞用GP2-293 包装细胞系 (Clontech) 磷酸钙沉淀法转染。 3.8 糖氧剥夺技术 (Oxygen-glucose D
14、eprivation,OGD) 细胞培养液暴露于 OGD星形胶质细胞的媒体 (5%C02/95%N2孵育 30 分钟 ) 。缺氧是通过将培养液放入培养箱 , 给予 C02/N2(5%,95%)的空气流 15分钟 , 之后 , 如前所述于置于关闭的培养箱3 小时。在 37,5%C02/95%空气 , 接近100%湿度的正常培养液中复苏( 孵育液最低条件 5mmol/L 葡萄糖和 10%胎牛血清 )不同时间点 (1 、 12、24、 48 小时 ) 。3.9 四甲基偶氮唑盐比色法 (MTT方法 ) 采用 MTT法测定细胞活性 , 全自动酶标仪测定 ( 测试波长为 570nm)各孔吸光度 , 未经处
15、理的对照组吸光度代表100%,各平行孔取均值后用以下公式计算细胞相对存活率: 细胞相对存活率 %=(OD实验组/OD 正常组 ) 100。3.10 免疫印迹分析星形胶质细胞的表达免疫印迹法检测星型胶质细胞 ,Psup 星形胶质细胞和 shRNA星形胶质细胞中对照组和 OGD组 1 小时、 12 小时、 24 小时及 48 小时的蛋白表达。 4 结果 4.1 一般情况与假手术组相比 , 缺氧缺血后 1 小时组 (T1h), 缺氧缺血后 12 小时组 (T12h), 缺氧缺血后 24 小时组 (T24h) 缺氧缺血后 48 小时组 (T48h) 之间体重无统计学差别 (P>0.05) 。4.2 模型成功标志缺氧缺血组乳鼠结扎左颈总动脉后 , 给予缺氧处理。缺氧约 10min, 所有乳鼠烦躁不安 , 活动增多 ; 缺氧 15 20min, 可以看到乳鼠口鼻周明显发绀 , 呼吸困难 , 呼吸频率增快 ;20 30min 出现站立不稳 , 摇摇摆摆 , 爬行时下肢拖步
