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1、高中生物竞赛辅导讲座 第十一讲生物学实验（一）基本技术1、显微镜基本实验技术（1）显微镜的主要性能分辨力：也称分辨本领，是指区分两个物点之间的最小距离的能力。能把两点分辨开的最小距离叫分辨距离。分辨距离越小，则分辨力越高；相反则低，所以，分辨力以分辨距离来表示。一般肉眼的分辨距离为0、25mm左右，所以比这个距离小的两点会被误看成一点。显微镜也有它的分辨距离和分辨力，这是显微镜性能中最重要的指标，它主要由物镜性能所决定。显微镜的分辨距离跟照明光的波长和物镜镜口率有关，可以用如下公式表示：分辨距离（R）0、61/ NA：照明光波长 NA：物镜镜口率从上式可见：照明光波越短，物镜镜口率越大，分辨力
2、越高。一般可见光的彼长范围为400700nm，若使用镜口率为1、25油镜，用可见光中最短波长的紫色光，则分辨距离约为0、2m，这是一般光学显微镜分辨力极限。用高速电子束（其波长短到0、005nm）作为电子显微镜照明，分辨力可达0、2nm左右。比光学显微镜分辨力提高1000倍。镜像亮度：镜像亮度与物镜镜口率平方成正比，与总放大倍数成反比，即镜口率越大，镜像亮度越大；总放大倍数越高，镜像亮度越小。所以，总放大倍敢相同情况下，要使镜像亮度增加，就应使用镜口率的物镜与低倍目镜配合。例如：总放大倍数都是200倍，则用镜口率为0、65的40物镜与5目镜配合，其镜像亮度比使用镜口率为0、25的10物镜与20
3、 目镜的镜像亮度高6、75倍。因目镜放大倍数过大，得到的放大虚像很不清晰。视野宽度：目镇光柱所围绕的圆即视野宽度，视野宽度越大，观察标本的面积越大，则显微镜放大倍数越小。所以，视野宽度与放大率成反比。因此，当将低借物镜转换成高倍物镜时，必须先把标本移到视野正中央。否则玻片标本的影像会落到缩小视野的外面。清晰度：清晰度是指显微镜能形成明显物像的能力，影响物像清晰度的主要是物镜，由于照明光的光谱不同，造成色差和透镜本身球面像差。放大倍数越高，像差越大，像就越模糊。（2）高倍镜的使用选好目标：由于高倍物镜只能把低倍镜视野中心的一小部分放大，因此，使用高倍镜前，应先在低倍镜中找到需要观察的部分，并移到
4、视野的中央，再换高倍镜，并使之合轴，即使其与镜筒成一直线（因高倍镜工作距离短，操作时要特别小心，以防镜头砸破玻片而损坏）。调正焦点：在正常情况下，当高倍物镜转正之后，在视野中可见到模糊的物像，只要略微调节细准焦螺旋，就可获得最清晰的物像。如果高倍物镜不是原装的，常会出现下述两种情况：高倍镜碰到玻片标本，或高倍物镜离玻片标本较远，这时则需重新用高倍镜调焦，调焦方法与低倍镜相同。换用高倍镜观察时，视野变小变暗，需重新调节视野亮度。可升高聚光器或放大虹彩光圈。（3）油镜的使用先用低倍镜找到所要观察的物体，再换至高倍镜下，将物体置于视野的中央，并使聚光器所收集的光达到最大亮度。将镜筒向上旋，并且将香柏
5、油滴一小滴于盖玻片上，油滴不可太大，以免损坏标本和镜头。将油镜缓缓放下，使油镜头浸入油液，靠近观察物。然后边观察边用细准焦螺旋，由下向上调节，找到物像，此时需分小心，否则，会将玻片压碎或使镜头损坏。观察完毕后，重新将镜筒向上旋，并先用擦镜纸擦拭掉镜头上的香柏油，再用棉球或擦镜纸蘸少许清洁剂（二甲苯或乙醚：无水酒精73配制的混合液）将镜头残留的油迹擦去，清洁液不可太多，否则会渗入镜头，使镜头受损。2、简单的染色技术（1）木质化细胞壁的染色方法番红染色法番红是一种碱性染料，可使木质化、栓质化和角质化的细胞壁及细胞核中的染色质和染色体染成红色，在植物组织制片中常与固绿配合进行对染，是最常用的染色剂之
6、一，常用配方有下列两种：番红水液：取0、1g番红，溶于100ml蒸馏水中，过滤后备用。番红酒精液：取0、5g或1g番红，溶于100ml50%酒精中，过滤后备用。间苯三酚染色法将切片材料置于载玻片上，用一滴间苯三酚（5%水溶液），再加一滴盐酸，几秒钟后用吸水纸吸去多余的染料，可见材料中有红色出现，然后加一滴水，盖上盖玻片便可镜检观察（如有条件最好用甘油封片，因加水后观察时间过长容易脱色）。由于用间苯三酚染色分色清楚，木质化细胞壁被染成红色，其余部分均不着色，常用于观察根、茎、叶等营养器官。但此法不能制成永久切片，因为时间稍久易褪色。（2）细胞质的染色法碘一碘化钾染色法将材料置于载玻片上，加一滴碘
7、一碘化钾溶液（碘化钾3g，加水5ml，加热溶解后，加入1g碘，再稀释至300ml，放棕色瓶中保存）510分钟后便可镜检观察，可见到该组织的细胞质被染成淡黄色，细胞核呈黄褐色（此法常用于观察洋葱表皮细胞，除其细胞质和细胞核着色外，液泡也稍带淡黄色）。碘一碘化钾也可用于签定淀粉，淀粉遇碘呈蓝色或蓝紫色。碘一碘化钾还可将蛋白质颗粒染成黄色。曙红染色法将材料置于载玻片上，加一滴曙红溶液（1g曙红溶于99ml水中或溶于99ml70%的酒精中），加盖玻片镜检观察，可见到细胞质被染成红色。用苏丹或苏丹的酒精溶液可把细胞质中的油滴染成橘红色，但要注意如果时间过长，其中的酒精可溶解油脂而褪色，且这不是专一的反应
8、，苏丹、均能使树脂、挥发油、角质和栓质。（3）细胞核或染色体染色法将材料置于载玻片上，加一滴醋酸洋红溶液（在煮沸的45%的冰醋酸中加洋红粉至饱和，再加入微量的氢氧化铁，或投入一枚锈铁钉，冷却后过滤）约510分钟后，吸去多余的染料，加水制片观察，可见到细胞核或染色体被染成紫色（此法常用于观察细胞分裂）。虽然碘一碘化钾溶液也可以将细胞核染成黄褐色，但由于细胞内其他部分也着色，所以不如用醋酸洋红理想（用1%的龙胆紫代替醋酸洋红，染色一分钟效果也很理想）。3、玻片制作技术（1）临时装片法临时装片法是用新鲜的少量的植物材料（如单个细胞、薄的表皮或切成的薄片等），放在载玻片上的水滴中，再盖上盖玻片做成玻片
9、标本的方法。这种方法制成的标本，一般多作为临时观察使用。制作方法如下：擦净载玻片和盖玻片，即将浸洗过的玻片用纱布擦干。用玻璃滴管吸水，滴一滴在载玻片的中央。用液管或毛笔挑选小而薄的材料，放置于载玻片上的水滴中。加盖片：右手持镊子，轻轻夹住盖玻片，使盖玻片边缘与材料左边水滴的边缘接触，然后慢慢向下落，放平盖玻片。这样可使盖玻片下的空气逐渐被水挤掉，以免产生气泡。如果盖玻片下的水分过多，则材料和盖玻片容易浮动，影响观察，可用吸水纸条从盖玻片的侧面吸去部分水。如果水未充满盖玻片时，容易产生气泡，可从盖玻片的一侧再滴入一滴清水，将气泡驱走，即可进行观察。如果这种临时装片尚需保存一段时间，则可用10%3
10、0%甘油水溶液代替清水封片。并将用甘油封好的装片平放于大培养皿中（培养皿底部先垫一湿滤纸）保存。（2）徒手切片法徒手切片的方法是常用的最简便的观察植物内部构造的方法。剃刀是徒手切片的重要工具，目前使用更普遍的是双面刀片，每次用后必须擦净，注意保护，以免生锈。材料的选择：一般选用软硬适度的植物根、茎或叶等，材料不宜太硬也不太软。切太软的材料时，可用马铃薯块茎、胡萝卜根或肥皂将欲切的材料夹住，一起进行切片。有些叶片亦可卷成筒状再进行切片。欲切的材料，应先截成适当的段块，一般面积的大小以不超过35平方毫米为宜，长度以23厘米较便于手持并进行切片。徒手切片的方法和步骤：）切片前，在小培养皿中盛以清水，
11、准备好毛笔、滴管和刀片等用具和欲切的材料。）切片时用左手的三个指头拿住材料，并使其稍突出在手指之上，以免刀口损伤手指。右手持剃刀或双面刀片，平放在左手的食指之上，刀口向内，且与材料断面平行，然后以均匀的动作，自左前方向右后方滑行切片，注意要用整个手臂向后拉（手腕不必用力）。切片时动作要敏捷，材料要一次切下（注意整个切片过程中应用清水湿润材料和刀面，使之滑润，否则材料容易破损）。如此连续动作，切下许多薄片后，就用湿毛笔将这些薄片轻轻移入已盛水的培养皿中备用。）用毛笔挑选薄而透明的切片，取出放在载玻片上，制成临时装片观察；亦可用其制成永久的玻片标本。（3）组织离析法离析法的原理是用一些化学药品配成
12、离析液，使细胞的胞间层溶解，因而细胞彼此分离，获得分散的、单个的完整细胞，以便观察不同组织的细胞形态和特征。离析液的种类很多，最常用的有铬酸硝酸离析液，它是以10%铬酸液和10%硝酸液等量混合而成。适用于木质化的组织，如导管、管胞、纤维、石细胞等。具体步骤如下：将植物材料（如木材、枝条、果壳等）先切成小块或小条（火柴棍粗细，长约1厘米），放入平底管中，加入上述离析液，其量约为材料的10倍，盖紧瓶塞，放在40左右的温箱中，约经12天。具体浸渍的时间可因材料块的大小而不同，如果两天以后仍未分离，则可换新的离析液继续浸渍。草本植物可不必加温。检查材料是否离析：以细胞间的胞间层溶解、细胞彼此能够分开为
13、宜。可取出材料少许，放在载玻片上的水滴中，加盖片，用滴管的橡皮头轻轻敲压，若材料分离，表明浸渍时间已够。洗酸保存：倒去离析液，用清水浸洗已离析好的材料。将平底管静置，待材料下沉后，再倒去上面的清液，如此反复多次，至没有任何黄色为止（如有离心机、可将材料转人离心管、用离心机洗酸更为迅速），然后转移到70%酒精中保存备用。当需要时，可按临时装片法制片观察，或制成永久性的玻片标本。4、简单的显微化学测定显微化学方法是应用化学药剂处理植物的组织细胞，使其中某些微量的物质发生化学变化，从而产生特殊的染色反应，并通过显微镜来鉴定这些物质的性质及其分布状态的方法。其种类很多，下面仅介绍细胞壁的木质素成分和细
14、胞中主要的三种贮藏物质的显微化学方法。（1）淀粉的鉴定淀粉是植物体中主要的贮藏物质，它们在不同植物细胞中形成各种不同形状的颗粒，当稀释的碘一碘化钾溶液与淀粉作用时，形成碘化淀粉，呈蓝色的特殊反应。所以用碘液测试淀粉已成为最常用的方法。但需注意如果碘液过浓，会使碘化淀粉变黑，反而不利于淀粉粒轮纹及脐点的观察。（2）蛋白质（糊粉粒）的鉴定蛋白质是复杂的胶体，细胞内贮藏的蛋白质是没有生命的，呈比较稳定的状态，有无定形的、结晶状的或成为有固定形态的糊粉粒。糊粉粒是植物细胞中贮藏蛋白质的主要形式。测试蛋白质常用的方法也是用碘一碘化钾溶液，但浓度较大效果才好。当碘液与细胞中的蛋白质作用时，呈黄色反应。在显
15、微镜下观察时，可见黄色的颗粒状的糊粉粒。注意在进行这种蛋白质鉴定工作之前，须用酒精将材料进行处理，即在植物切片材料上滴加95%的酒精，首先把材料中的脂肪溶解掉，以保证蛋白质颜色反应的正确性，并能看清糊粉粒的结构。（3）脂肪和油滴的鉴定脂肪和油滴也是植物细胞贮藏的主要营养物质之一。脂肪在常温下为固体形态，油滴则呈液体状态，均不溶于水。常用的显示脂肪的显微化学方法是苏丹的酒精溶液染色，呈橘红色，但近年已多用苏丹的丙酮染液代替，其染色效果比前者稍红和明显。但该反应不是专一性的，苏丹、均能使树脂、挥发油、角质和检质染色。在鉴定过程中，为了效果明显，可稍加热以促进其反应。（4）木质素的测定木质素是芳香族
16、的化合物，在细胞壁中一般呈复合状态。用盐酸和间苯三酚先后处理植物材料，是细胞壁木质素成分的鉴别方法。根据颜色反应的深浅能显示壁中木质化的程度。鉴别时，一般要取新鲜植物材料的切片，置载玻片上，先加40%盐酸l2滴，约35分钟后，待材料被盐酸浸透，再加5%间苯三酚的酒精溶液，当间苯三酚与细胞壁中的木质素相遇时，即发生樱红色或紫红色的反应。导管、管胞、纤维和石细胞等细胞壁中木质素成分丰富，因此它们的颜色反应分典型。加盐酸的作用是由于间苯三酚需在酸性环境中才能发生上述反应。间苯三酚为白色粉末，易氧化变性，若已呈灰褐色或溶液已发黄，往往无效。（二）基本方法1、测微尺的使用方法及显微镜放大倍数的计算：测微尺的结构显微测微尺是由目镜测微尺（目尺）和台镜测微尺（台尺）所组成。目尺是块圆形玻片，被片的中心刻有一小的刻度尺，长5或10mm，分成50或100格。每格的实际长度因不同物镜的放大份数和不同镜筒长度而有所不同。台尺由一块载玻片制成。在玻片中央用树胶封固一圆形的测
