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1、1第十八章 脂肪酸和油脂副产物的分离纯化新技术1Udaya N. Wanasundara, 2P. K. J. P. D. Wanasundara, 3Fereidoon Shahidi（1. 加拿大萨斯喀彻温省萨斯卡通 POS 试验场公司，2.加拿大萨斯喀彻温省萨斯卡通加拿大农业和农业食品萨斯卡通研究中心，3.加拿大圣约翰纽芬兰纽芬兰纪念大学）第一节 引言油脂是根据它们在有机溶剂中的溶解度不同而进行分类的一组化合物，包括几类具有相关性但化学和物理性质不同的化合物。大多数油脂的主要成分是甘油三酯（TAGs） ，准确的说它们是甘油和三个脂肪酸形成的酯。在从种子、果皮或果仁中萃取油脂时，伴随甘油三
2、酯的其它化合物，如磷脂、色素、生育酚、甾固醇类等也分离出来。当油用作食用时，这些同时萃取出来的脂溶性物质使产品形成不良味道和非期望色泽，有时货架期缩短。随着食用油脂工业技术的发展后，毛油通过精炼得到主要成分甘油三酯（TAGs） 。在精炼过程同时将几种具有较高商业价值的成分分离出来。越来越多的科学证据证实，这些成分具有潜在的健康益处和功能用途，已做出投入很多努力力量来分离和浓缩这些微量成分。虽然食用油脂的主要分子形式是甘油三酯，但也很有必要根据其化学成分来分离食用油，或用不同方式对其进行改性。第二节 制取脂肪酸的方法在以油脂为原料获得的产品中，脂肪酸的产量最大，其用途从矿物油的净化到用于食物、药
3、品。自然界中，脂肪酸以游离状态或大部分以酯化形式存在。脂肪酸根据碳链长度和碳碳双键的数目分类。各类脂肪具有自己的脂肪酸特征组成。已经建立了从天然原料中分离（或浓缩）和提取特殊脂肪酸及其衍生物（及其酯、游离脂肪酸、甘油三酯等）的多种方法，但只有极少数方法适合大规模生产。这些可行方法包括色谱（吸附和分离） 、分馏或分子蒸馏、酶水解、低温结晶、超临界流体萃取和尿素络合。每一种方法都有其优点和缺点。油脂中大多数的脂肪酸以甘油酯的形式存在，这些与甘油相酯化的甘油酯是构成油脂的主要组分。例如，在棕榈油中，脂肪酸的天然混合物可分为两个组成部分，即“软脂 ”，它含尽可能少的饱和脂肪酸，另一个是“硬脂”，含尽可
4、能少的不饱和脂肪酸。不管采用那一种分离工艺，起始的脂肪酸混合物或“原料” 应达到一定标准。对于原料而言，高质量产品的脂肪酸应未被破坏（如氧化、异构化最少） ，脂肪酸以甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯以及脂肪酸盐形式存在时杂质含量很低 1。Guessrow 最早报道了脂肪酸的分离 2。将直链饱和脂肪酸与直链不饱和脂肪酸分离，首先要制备铅盐衍生物，将混合盐溶解在乙醚或乙醇中，然后将不可溶2的饱和酸从可溶的不饱和酸中分离出来。这是一种非常有效的方法，但需要大量溶剂并且要预先制备脂肪酸盐，这使得该工艺很难应用到在商业规模化生产中采用 3。工业化脂肪酸的经典分离工艺包括分盘压榨法 4,5、Solexol 工
5、艺 611、Emersol 工艺 1215、Armour-Texaco 工艺 16,17和 Henkel 工艺 1822。经典的分盘压榨法根据熔点的不同来分离软脂和硬脂组分。Lanza、Henkel、或 Lipofrac 工艺是利用熔点不同而研发出来的自动分离工艺。Solexol 和 Emersol工艺利用液液逆流萃取与熔点差异相结合的方法来分离脂肪酸，从而得到较高纯度的脂肪酸产品。Armour-Texaco 工艺与 Emersol 工艺相似，但用丙酮代替甲醇做溶剂。这些方法的焦点都集中在硬脂酸和油酸的提取上。但这些方法不适合分离高价值的脂肪酸。目前对各种脂肪酸的需求，包括长链多不饱和脂肪酸（
6、PUFA） ，可能需要结合不同工艺来进一步分离脂肪酸。2.1 经典方法及其进展分离脂肪酸的原理是基于每种酸或酸基团的特性。在分离技术的发展过程中，主要用到两种性质（蒸气压和熔点的差异） 。脂肪酸混合物的蒸汽压随脂肪酸链长的变化而发生大幅度变化，这一点可用作分馏分离长链脂肪酸和短链脂肪酸的方法。但蒸气压不随不饱和度的改变而有很大变化不大。脂肪酸的熔点随其不饱和度而变化很大，因此可以用另一种方法将混合脂肪酸分离成饱和组分与不饱和组分。通过改变混合物的温度，脂肪酸就可以在其各自结晶温度时，依据其不同的不饱和度而分离。2.1.1 普通色谱法Smith23和 Elsden24报道了短链脂肪酸色谱分离的经
7、典方法。据报道利用氧化铝吸附层析柱 25可以纯化花生四烯酸甲酯，利用硅胶柱 26可纯化不饱和脂肪酸。以乳胶为固定相，可以用分配色谱 27,28来分离脂肪酸。用含水丙酮和甲醇作为流动相可分离长链多不饱和脂肪酸与甘油酯，用硅油或合成的聚合物浸渍滤纸。Boldingh28报道了使用花生油饱和的乳胶粉末为固定相，甲醇/丙酮或甲醇/ 水为流动相的反相柱层析法分离脂肪酸。脂肪酸气-液相色谱分离方法首次在 1952 年发表 29，描述了 1 到 12 个碳的脂肪酸的分离方法。同一研究小组接着又发现脂肪酸的预甲酯化可以提高它在高温下的挥发性和分离度。所用的固定相是硅油与硅藻土 Celite 545 掺合的固体
8、粉末担体，将其填充于玻璃柱中。Orr 和 Catten30描述了一种以液体聚酯为固定相来分离饱和与不饱和脂肪酸的方法。后来，引入了具有各种极性相薄膜的毛细管柱，根据脂肪酸的碳原子数、不饱和度、异构化等来提高脂肪酸的分离效果。色谱分离广泛应用于高纯度脂肪酸的提取。脂肪酸分离用的数种专利已经获得了授权，这些专利采用不同类型的吸附剂和技术。固定床色谱系统可以使用非极性固定相（如反相色谱系统）或极性固定性（正相色谱系统） 。在多种油脂化3工产品（脂肪醇、烷醇酰胺、-磺酸甲酯、蔗糖酯和其它酯）的生产中，脂肪酸甲酯可以作为脂肪酸的替代品。甲酯比脂肪酸更好，因为它们产品纯度更高，合成的条件更温和。甲酯通过油
9、脂在碱性催化剂作用下醇解获得，通常是甲醇钠存在下与甲醇反应获得；或通过 Colgate-Emery 工艺（该工艺需大量资金且耗能）水解脂肪，接着加入甲醇与水解的脂肪酸酯化 31。分子筛吸附技术已得到广泛研究，并已应用于从混合脂肪酸中分离或浓缩分离饱和、单不饱和、二不饱和脂肪酸中分离或浓缩。Logan 和 Underwood32发明了一种专利方法，即根据不饱和度，用沸石作为吸附剂来分离脂肪酸酯。非离子的、疏水交联的聚合物也成功应用在脂肪酸的选择性分离上 33。脂肪酸首先被吸附在含特定吸附剂的固体床上，然后用一个合适的洗脱剂来洗脱吸附的脂肪酸。尽管气相色谱分离法用于分析目的是可行的，而液相色谱方法
10、更适用于制备和工业规模化分离脂肪酸或脂肪酸酯。脂肪酸的液相色谱分离方法也用在从食品或药品的混合物中得到特定脂肪酸或脂肪酸酯的浓缩物。为了得到高纯度的长链多不饱和脂肪酸（PUFA）单体，已对液相色谱方法进行了很详尽研究。Nakahara 等 34报道了以丙酮/乙腈为流动相、十八烷基硅烷键(ODS) 为固定相，从海洋微藻中（例如裂壶藻）分离含二十二碳六烯酸(DAH)和二十二碳五烯酸(DPA) 甘油三酯（TAG）的反相液相色谱法。这种固定相分离甘油三酯（TAG ）的原理是基于固定相与甘油三酯（TAG）中脂肪酸残基之间的范德华力强度的差异。根据脂肪酸中双键的数目和双键的构型（顺式或反式） ，用硝酸银硅
11、胶来分离脂肪酸甲酯单体，在脂肪酸分离工艺中是一个大进步。此分离技术的原理就是金属离子(例如：银离子) 与不饱和脂肪酸残基中碳原子中的一个碳碳双键 轨道中的电子可逆相配，形成一个金属络合物。络合物的范德华力大小取决于脂肪酸的链长，碳碳双键的数目，双键的位置和构型（顺或反） 。银（银离子）色谱和高效液相色谱（HPLC ）也一起用来分离脂肪酸。反相和银离子高效液相色谱两个分离原理都是依据多不饱和脂肪酸（FUFAs）的不饱和度来分离甘油三酯的 35。使用毛细管超临界液体色谱（25%丙基氰酯、75%聚甲基硅烷为固定相） ，使分离含相同酰基碳数和不饱和度的甘油三酯成为可能 36。Teshima 等 37利
12、用硝酸银浸泡过的硅胶柱分离鱿鱼肝脏油脂肪酸甲酯中的二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA） ，EPA 纯度为 85%-96%，DHA 纯度 95%-98%，产量分别为 39%和 48%。Corley 等 38利用由硅胶和银离子或镁离子组成的高效液相色谱（HPLC）柱从海藻油分离富含 DHA 的甘油三酯（TAG ） 。Hayashi 和 kishimura39使用硅胶酸柱，用正己烷、乙醚 /正己烷、乙醚进行分步洗脱从金枪鱼眼窝油中分离出纯度达 63%-74%的 DHA。Adlof 和 Emiken40利用银树脂柱通过等度洗脱从 -3FUFA（多不饱和脂肪酸）浓缩物中将 3 脂肪酸的含量从
13、 76.5%提高至 99.8%。在另一项研究中，同一批研究者通过在甲醇中增加乙4腈的含量（0-30% ，v/v） ，将 100mg 含 29.1%EPA、20.5% DHA 的鱼油甲酯浓缩物分离成含 87.7%EPA 和 95.4%DHA 的组分。他们通过用含 40%（v/v）乙腈的丙酮等度洗脱，分离了约含 12.5%EPA 和 11.1% DHA 的非浓缩鲱鱼油甲酯和脂肪酸，得到一种 EPA 和 DHA 总含量约为 69%的洗脱组分。色谱分离脂肪酸酯所用溶剂的选择，取决于洗脱组分期望得到的纯度、生产要求以及产品最终用途。已经用四氢呋喃/甲醇/水（25：55：20，v/v/v） 41和甲醇/水
14、(90:10,v/v) 42从鱼油脂肪酸乙酯中分离得到高纯度（75%-96%）的 EPA 和DHA。利用 Tokiwa 等 41的四氢呋喃体系，Krzynowek 等 43得到更高纯度的 EPA和 DHA 组分。但四氢呋喃具有氧化性很容易产生过氧化物，使多不饱和脂肪酸（PUFA）开始氧化分解，同时 THF 有潜在爆炸性。如果最终产品是人直接消费的，那么应该选择乙醇和水作溶剂。2.1.2逆流色谱法最近几年，逆流色谱（CCC）和离心分配色谱（CPC）在多不饱和脂肪酸的分离中得到更多的关注。这种新的色谱技术采用液液分离，溶质混合物在两种液相中进行逆流分配，在没有固体物支撑的情况下进行复杂化学物质的混
15、合物分离44,45。Ito 在 1964 年最先使用离心分配色谱（CPC） ，它是一个没有吸附剂的液液色谱，需有两种不互溶的溶剂相，该法基本上是逆流分配派生出来的，由 Craig 进一步开发 46。在最典型的 CPC 方法中，当第二种溶剂相通过固定相溶剂时，一种液相保持固定。分离原理是溶质在两种互不相容的溶剂之间分配。溶质进入两种溶剂相中的相对比例由各自的离心分配系数决定。CPC 是一个可用于大规模生产的分离技术，与传统的液固分离方法例如普通的柱层析色谱和高效液相色谱法相比，它在分离和纯化天然产品方面具有明显优势。CPC 不需要用固体担体作为固定相。因此，消除了样品中高吸附力成分的不可逆吸附的
16、可能性。事实上由于这个原因，这种色谱法实际上可以确保几乎 100%回收化合物。任何两相溶剂系统都可用，很多分配体系可用那些无毒的易得的溶剂来构建。离心分配色谱中，固定相的体积占柱总体积（转子）的比例比传统液相色谱大。因此固定相保留样品物料的量很大。在传统填充色谱柱中，昂贵样品组分通常发生分解和变性，而 CPC 操作条件温和，不存在这种现象。CPC 在任何pH 条件下都可以使用。不需考虑 CPC 中固体担体（如二氧化硅、氧化铝等）对pH 值会造成影响。CPC 的另一个优点是溶剂消耗量较低，正相和反相洗脱都可以用相同的一对溶剂。CPC 很容易进行大规模连续分离。其全部过程在一个液相密闭系统中进行。所以环保问题降到了最低，而且溶剂可以全部回收循环利用 45。CPC 仪器有两种基本类型：一种是日本京都 Sanki 工程公司制造的离心分配5色谱，另一种是由 Ito 设计，马里兰州巴尔的摩制药技术研究公司制造
