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1、1 引物的设计以及初步筛选 引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成的， 目前运用软件 Primer Premier 5 或美国 whitehead 生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款免费在线 PCR 引物设计程序 Primer 3 来设计引物，再用软件 Oligo 6 进行引物评估，就可以初步获得一组比较满意的引物。但是对于初学者来说，运用软件和程序来设计引物好象无从着手，其实只要我们掌握了引物设计的基本原则和注意事项，所有问题便迎刃而解。因为无论是软件还是程序，都是以这些基本原则和注意事项为默认标准来进行引物设计的。所以，我们在进行引物设计的时候大可不
2、必在软件和程序的参数上花费过多的时间来思考，如果没有特殊要求我们完全可以把一些参数设为默认值。下面我们主要讨论一下引物设计的原则和注意事项。 引物的长度一般为 15-30 bp，最好在 1824 bp，因为太短易形成错配(False priming) 降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量21。 引物在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。特别是 3端，一定要避免连续 4 个以上的碱基互补错配。 引物序列的 GC 含量最好在 40一 60，且上下游引物序列 GC 含量的差异不要太大，3端最后 5 个碱基最好不要富含 GC，特别是连续 3 个的 G 或 C。 DNA 双链形成
3、所需的自由能 AG，应该以 5端向 3端递减，3端 AG 最好不要高于 90 keaf mol31。 避免形成稳定的引物二聚体(Dimer and Cross DimeO 和发夹结构(Hairpin)，AG高于 45 kealmol 时易引发 上述两种结构的产生。 引物所在的模板区域应该位于外显子区，最好跨越一个内含子区，这样便于对扩增出 来的片段进行功能鉴定和表型分析。 如果以 DNA 为模板设计引物，产物长度在 100600 bp 比较理想。而以 mRNA 为模板设计引物时，产物长度在 150300 bp 比较理想。 5 端对 PCR 影响不太大，可以引进修饰位点和标记物2。 只要掌握了以
4、上原则和注意事项，我们可以在软件和程序设计的一组引物中筛选出几对我们需要的目标引物。Primer Premier 5 和 Oligo 6 可以在 的主页位置在 http:/www.genome.wi.mit.edu。 2 引物的二次筛选 引物的二次筛选是指在初次筛选出的几对引物中进一步筛选出适合我们进行特异、高效 PCR 扩增的那对引物。本步应注意以下两点， 一是得到的一系列引物分别在 Genebank 中进行回检。也就是把每条引物在比对工具(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) 的blastnr 中进行同源性检索，弃掉与基因组其它部分同源性比较高的引物，也就
5、是有可能形成错配的引物。一般连续 10 bp 以上的同源有可能形成比较稳定的错配，特别是引物的3端应避免连续 5-6 bp 的同源。二是以 mRNA 为模板设计引物时要先利用生物信息学的知识大致判断外显子与内含子的剪接位点(例如 http:/CCR-081.mit.edu/GENESCAN.html 的GENESCAN 工具或者 GeneParser 软 ，然后弃掉正好位于剪接位点的引物。 3 引物的最终评估 当我们经过初次筛选和二次筛选后得到的那对引物便可以用于合成，合成后我们经过 PCR 扩增可以对引物进行最终的评估。一是 PCR 扩增的特异性和效率。经过 PCR 条件优化后能否获得特异性
6、条带，即无目的条带之外的多余条带。另外，PCR 产物的量是否足够，即无不出带和条带很弱的现象。二是以 DNA 为模板设计引物时，PCR 扩增产物是否与预期 PCR 产物大小相当。如果相差太大 G 于 100 b ，有可能是错配产物。三是是否形成引物二聚体带。 我们结合引物最终评估和测序的结果可以对引物设计的成败做出鉴定，为我们以后进行引物设计积累宝贵经验。 4 用比较基因组学分离新基因时引物设计的注意事项 扩增已知基因时经过初次筛选和二次筛选后得到的引物基本上能够满足要求，但是当运用比较基因组学分离新基因时，设计引物还应注意以下两点： 模板的选择。如果以DNA 为模板设计引物， 首先在 Gen
7、ebank 中找到与待分离新基因同源的其它物种的该基因。利用 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/的 Blast 工具和 http:/www.ebi.ac.uk/elustalw/的 Clustalw 工具把已检索到的基因进行同源性比较，根据比较基因组定位的原理，选择研究深入、标记稠密的人和哺乳动物(如小鼠)保守功能基因 DNA 序列设计引物51，该引物区段要求在各物种间绝对保守，差异不要大于 2 bp，特别是 3端必须完全同源。如果以电脑克隆策略获得的待分离物种新基因的 EST 一重叠群为模板设计引物，要求 ESTs 与信息探针之间同源性大于 80，长度大于 1
8、00 bp，并且避免在 EST 的并接部位和可能的外显子与内含子剪接位点处设计引物。引物序列最好位于相临的外显子区且至少距离外显子与内含子剪接处 25 bD 以上 ，这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。 PCR 技术的基本原理 PCR 技术的基本原理：该技术是在模板 DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于 DNA 聚合酶的酶促合成反应。DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板，借助一小段双链 DNA 来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链 DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物 3-OH 末端，
9、并以此为起始点，沿模板 53方向延伸，合成一条新的 DNA 互补链。PCR 反应的基本成分包括：模板 DNA(待扩增 DNA)、引物、4 种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA 聚合酶和适宜的缓冲液。类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA 的高温变性：模板 DNA 经加热至 93左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板 DNA 与引物的低温退火(复性 )：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55左右
10、，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；引物的适温延伸：DNA 模板-引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟， 23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR 的反应动力学： PCR 的三个反应步骤反复进行，使 DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的 DNA 扩增量可用 Y(1X)n 计算。Y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数，X 表示平(Y
11、)均每次的扩增效率，n 代表循环次数。平均扩增效率的理论值为 100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式，随着 PCR 产物的逐渐积累，被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及 DNA 聚合酶 PCR 的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。PCR 扩增产物 ：可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链 5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而
12、形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中， 以两条互补的 DNA 为模板，引物是从 3端开始延伸， 其 5端是固定的，3 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时， 由于新链模板的 5端序列是固定的， 这就等于这次延伸的片段 3端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加， 而“长产物片段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计， 这使得 PCR 的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯 D
13、NA 片段供分析与检测用。引物设计的原理和程序（多图）一、设计原理 1、择合适的靶序列:设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守，碱基分布均匀的区域进行引物设计。 2,、长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为 1530bp. 3、 Tm 值：引物的 Tm 值一般控制在 5560，尽可能保证上下游引物的 Tm 值一致，一般不超过 2。若引物中的 G+C 含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。 4、(G+C)含量:有效引物中 (G+C)的比例一般为 4060%。 5、碱基的随机分布:引物中四种碱基的分布最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3端不应超过 3 个
14、连续的 G 或 C. 6、 引物自身：引物自身不存在连续 4 个碱基以上的互补序列，如回文结构，发夹结构等，否则会影响到引物与模板之间的复性结合，尤其避免 3末端的互补。 二、引物设计操作流程序列下载 同源性比较 引物设计筛选1、序列查找 根据所需检测的病原体或者待检特定基因，在 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed 网址查询有关序列。 2,同源性比较主要有两种方法 1）在 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi 网址进行在线的两两比较。 2）采用 OMIGA, PCGENE 等软件进行两两或多序列比较。 打开 OMIGA 软件，
15、导入(import)下载存盘的纯文本序列文件: 选择待比较的多条序列，右键点击align sequences命令； 等待计算机处理，直至状态显示排列结束，点击alignment显示结果；alignment结果，相同碱基以同色标记三、引物设计与筛选 Primer Premier 5.0 软件为例，进行引物设计和筛选的操作示范 1、打开软件，调入序列2、选择路径，选择序列文件名，加入右框3、序列文件显示如图，点击primer；4、按照引物设计的原理，设定引物的各种参数，点击 确定进行引物搜寻；5、等待引物搜寻，显示结束后，点击 确定，进入下一页；6、按照搜寻结果显示，逐条分析，在主窗口中检查该引物
16、对的二级结构情况，依次筛选引物设计软件 oligo 应用图解 2008-04-24 22:44:11 | Author: colacat 在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和G 图；Oligo 6.0 的界面更复杂，出现三个图，加了个 Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。oligo 的下载和安装我就不多说了，打开 oligo 相信也无需多讲。打开 oligo 的页面如下：单击 file 菜单再点 open 或点击“打开”
