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1、溶胶凝胶技术在电化学传感器中的应用进展摘 要 本文主要评述了近年来溶胶凝胶技术在电化学传感器中的研究进展，包括在测定酚、葡萄糖类等物质实验方面的介绍，并探究了溶胶一凝胶与血红蛋白有较好的生物兼容性。结合了碳纳米管方面的应用制备了一种性能优良的葡萄糖生物传感器。 关键词 溶胶-凝胶；电化学传感器；葡萄糖；碳纳米管；1 引言溶胶一凝胶技术是指有机或无机化合物经过溶液、溶胶、凝胶而固化，再经过热处理而制得氧化物或其他化合物固体的方法。近年来，人们发现溶胶一凝胶材料是一类非常适合于固定生物试剂的基质材料1-5 凝胶过程通常在温和的条件下进行，可以很大程度地保持酶等生物物质的功能和活性L6-7利用溶胶一
2、凝胶技术固定各种生物试剂基质材料，制成的生物传感器具有灵敏度高、稳定性好、抗干扰能力强等特点8-11 溶胶凝胶包埋酶的过程中，胶体粒子逐渐聚集形成三维网络结构。一些添加剂聚乙二醇(PEG)，聚乙烯胺(PEI)等覆盖硅胶中，能提高酶的活性。同时也能减少溶胶凝胶的收缩，作为孔径填充物防止孔塌陷。研究中发现将多羟基高分子掺人溶胶中，由于形成互穿网络而显著增大了凝胶的强度，从而防止了干裂。陈化时间对凝胶孑L径大小、交联程度有较大的影响。同时，在不同的介质中陈化时，也会得到不同的凝胶干缩结构，如在酸性介质中，得到的凝胶结构致密，孔径较小，故有利于酶分子的包埋。利用溶胶一凝胶技术固定生物酶制备的生物传感器
3、在测酚、有机溶剂和糖类等物质中有着很好的效果。2 溶胶-凝胶技术固定生物酶制备的生物传感器测定酚、 糖类等物质2.1 测定含饱和苯系物废水中的酚类化合物采用正硅酸乙酯水解制备溶胶一凝胶包埋酶制作溶胶一凝胶电极，以提高电极的灵敏度，增强电极的选择性和抗干扰能力。测定了含饱和苯系物废水中的酚类化合物，。溶胶一凝胶的制备 先将TEOS溶于无水乙醇，加入一定量水，用HC1调节溶液pH 值，然后放人梨形瓶中，恒温下用旋转蒸发仪定速搅拌水解一定时间后，再加入丙三醇继续搅拌，二次水解30 min。电极的制作 将石蜡碳糊填于预处理好的电极杆底部压实，在碳糊电极表面留有一层约1 妈妈深的凹槽，待用。称取01 m
4、g酪氨酸酶(50 000 U17mg)溶解于缓冲溶液(pH：70)中，加入陈化好的溶胶一凝胶搅拌均匀，再用碳粉调成糊状填人上述预留凹槽中并压实，在硫酸纸(放在光滑玻璃板上)上磨光，用渗析膜包好，置于冰箱冷藏室里陈化一天待用。电极使用前先在pH 54的磷酸盐缓冲溶液中浸润。电极不用时于冰箱中4保存。 溶胶一凝胶碳糊电极的制作及参数的优化设计8因素10水平的实验方法，并结合电极的响应灵敏度来确定酶电极制作中各组分最佳加入量，其中以反应完全、水解后呈均匀透明的溶胶、老化后呈粘稠状且均匀透明的凝胶、凝胶不干裂、滴膜光滑透明无裂痕、电极本底值最小及响应值最大作为评价溶胶和电极的标准。实验数据经过统计处理
5、后得到试验范围内的最佳工艺条件为：水和TEOS的摩尔比4：2；乙醇体积为25 ；溶液pH 值15；水解温度20；水解时间3 h；老化温度20；老化时间2 d。电极制作中溶胶-凝胶与缓冲溶液体积比为2：1。 溶胶一凝胶固定酪氨酸酶电极工作条件的确定工作电位的选择 采用制备的生物电极获得的循环伏安图如图1所示。根据所得的实验数据以及一些干扰离子的电位，确定本电极的工作电位为一100 mV。 溶液pH值和测量时间的选择 电极响应与溶液pH值的关系见图2。在pH值约52时电极的响应值最大，考虑到酪氨酸酶的适宜pH范围为6070，所以选择pH 54作为操作条件。由溶胶一凝胶电极的时间响应关系确定，响应时
6、间为3 min，这时电极响应值可达95 以上。电极性能测试检出限、线性范围及电极稳定性检出限根据信噪比SN 3来确定。相应实验数据列于表1。由表1的实验数据可以看出，电极在陈化一天后响应的灵敏度最高，但电极的稳定性不好，检测范围很窄；随着电极的使用，电极的稳定性和检出限都增大。其可能原因为随着电极表面在缓冲溶液中的浸润时间的增加和电极微表面的进化，校正了酶空间构型，使酶的活性中心外漏，易与底物接触，从而提高酶的活性。电极在使用24 h后稳定性和检测范围都增加了，但其响应值有递减的趋势，这可能与溶胶一凝胶对酶活性的影响有关，或者由于电极表面有其它物质(如醌氢醌)覆盖而受到抑制。 精密度和准确度标
7、样和样品浓度分别为1O010 molL和5O010一molL。在工作电位一100 mV，pH 54，响应时间3 min的条件下进行测定，电极在同一底物中6次试验结果的RSD为104 ，标样与样品测定值之间的相对误差为0002 。溶液中酚的测定对溶液中各种酚类进行了测定与比较，其结果列于表2。可以看出，国家标准方法(分光光度法)仅能测定苯酚、邻甲酚、间甲酚，无法测定其它酚类。本法对苯酚、邻甲酚、对氯苯酚、邻苯二酚、间甲酚响应较好。 电极抗干扰能力和对化工废水分析生物酶同含有苯及苯系物的化工废水接触将很快失活，实验采用溶胶一凝胶法在碳糊中固定生物酶制备生物传感器，解决了此问题。用本法对有苯及苯系物
8、的含酚10010一 molL的化工废水进行了分析，结果显示，测定值与参考值之间的相对误差为0007-0053。2.2硅溶胶-凝胶包埋纳米金和酶的葡萄糖生物传感器 参考文献12方法，将置于烘箱里，下放置约，得，完全冷却后用的盐酸溶液调节比重到.，过滤后得到澄清的水玻璃溶液。取出用水（体积比）稀释，再经过磺酸基型阳离子交换柱后，得到.的硅溶胶，备用。酶电极的制备金电极（直径为，实验室自制）用.的细砂纸湿磨电极，.的三氧化二铝粉抛光，随后依次用无水乙醇、亚沸水超声洗涤，最后将电极放在.的硫酸底液中，在.-.的电位范围内，以.的扫描速率进行电化学预处理，至稳定的循环伏安曲线（通常为），备用。将预处理后
9、的金电极浸入.硅溶胶、.（）、.半胱氨酸（）、.（质量分数为）、.金溶胶的均匀混合液中，约后取出，在下放置后得到酶电极。酶电极的电化学行为各电极在磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安曲线如图所示。由图可知，裸电极（曲线）和不加酶的修饰电极（曲线）没有电化学响应，而酶电极（曲线）出现了一对准可逆的氧化还原峰，在扫速为.时，其氧化峰电位为.，还原峰电位为.，这应该是葡萄糖氧化酶在电极表面发生电化学反应产生的。其氧化还原峰峰电流基本相同，因此，该反应是准可逆的直接电化学反应，式量电位约为.。与固定的电极相比较13，其式量电位显著正移，这可能是在金纳米粒子的表面形成了氧化物从而起到了一种潜在的促进剂作用，。酶电
10、极的氧化峰电流和还原峰电流均随电位扫描速率的增加而增大，二者在.的扫速范围内呈良好的线性关系。随扫速的增加，阴极峰电位负移，阳极峰电位正移，电极过程可逆性变差。溶液的酸度会影响固定化的活性，同时影响有质子参与的催化氧化过程。随着缓冲溶液的增加，式量电位呈线性下降，斜率为。图说明了检测底液对传感器循环伏安阴极峰电流的影响。在时，酶电极的电化学活性最高。酶电极制备条件的优化本文采用硅酸作为溶胶凝胶的前驱体，与采用烷基硅的前驱体相比，避免了乙醇的产生，有利于酶活性的保持。硅溶胶凝胶膜的孔径在左右，因此，本实验采用平均粒径为的金纳米粒子，可保证纳米粒子在膜中的固定而不流出。图为金纳米粒子的紫外可见光谱
11、图和透射电子显微镜图。当每毫升混合溶液中金溶胶的量大于.时，可得到稳定的电流响应。电极的酶负载量是一个极重要的因素。图为不同酶固定量与阴极峰电流的关系。从图中可看出，当体系中含量在时，酶电极的峰电流响应最大。本实验采用加入的。-的浓度也显著影响酶电极的电流响应。图为体系中加入-对酶电极阴极峰电流的影响。随着-浓度的增加，峰电流随之增大，浓度达到.后趋于稳定。-的加入，可通过自组装的方式在电极与酶之间形成一座桥梁，有利于酶与电极间的电子传递。因此，本文中加入-量为.。酶电极对葡萄糖的安培响应为了考察固定在电极表面的是否保持其生物电催化活性，本文研究了酶电极对葡萄糖的电化学响应。图为典型的酶电极对
12、葡萄糖的电流与时间响应曲线。传感器对葡萄糖的响应时间小于，说明该反应是一个快速过程。这可能硅溶胶凝胶薄膜是多孔网状结构，金纳米粒子的加入有利于酶在电极表面的取向并增加了导电性，有利于酶与电极间的电子传递作用。传感器对葡萄糖的线性响应范围为.，线性回归方程为（）.（），检出限为。检测灵敏度与酶介体型葡萄糖氧化酶电极16相近，优于金纳米粒子固定的葡萄糖氧化酶电极17.18。抗干扰性能葡萄糖生物传感器在测试血液样品时，主要的干扰可能来自具有电化学活性的抗坏血酸和尿酸。该酶电极的工作电位低（.），因此具有很高的选择性，对于.的葡萄糖，同样量的抗坏血酸和尿酸均不产生明显的干扰。酶电极的稳定性与重现性取支
13、不同修饰的酶电极对.的葡萄糖溶液进行测试，相对标准偏差为.。同一酶电极对.的葡萄糖溶液平行测定次，标准偏差为.。当酶电极在下保存，并间断使用后，该电极对葡萄糖的响应仍保持初始响应的。电极稳定性显著优于文献报道，的和。说明葡萄糖氧化酶与金纳米粒子同时固定于硅凝胶的三维网络结构中，可很好地保持酶的催化活性。样品测试采用标准加入法测定血清样品中葡萄糖的浓度，测得值与健康人体血液中的正常值相符，回收率在 之间。3 溶胶一凝胶血红蛋白电化学传感器的研制 玻碳电极的处理将玻碳电极用氧化铝粉抛光，在二次水和无水乙醇中分别超声洗涤5 min，并重复3次，然后进行电化学活化处理，即在05 molL的H2SO4中
14、于一O3 V15 V进行循环伏安(CV)扫描，直到获得稳定的循环伏安响应储备液的配制血红蛋白(Hemoglobin，Hb)储备液：称取50 mg牛血红蛋白，用水稀释，并定容至1O ml的容量瓶中，避光4保存，使用时逐级稀释溶胶一凝胶储备液：在室温下将1ml正硅酸乙酯，02ml 01 molL的HC1和3 ml水、1Oml乙醇混合于20ml密封瓶中，超声震荡30min，至形成均一溶胶液，密封存放于阴暗处表面活性剂储备液：称取025 g十六烷基三甲基溴化铵，加10ml乙醇溶解，用水定容至25ml，密封保存HbSolGelGC修饰电极的制备取配制好的溶胶一凝胶储备液和表面活性剂储备液各1 ml，搅拌均匀后加入05 ml血红蛋白(Hemoglobin，Hb)储备液，置于一密闭容器中超声震荡5 rain，使其分散均匀吸取8 L该溶液，均匀涂敷在玻碳电极表面，置于4冰箱中干燥10 h以上，即可制得HbSolGelGC修饰电极该电极不用时可将其置于邻苯二甲酸氢钾缓冲液(pH一6)中并放入4冰箱中保存相同条件下制备SolGelGC
