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1、 实验一 实验前准备一、目的及要求组织细胞培养技术要求无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响，因此，了解细胞培养实验室的设置和设备，掌握培养用品的清洗和消毒灭菌是进行试验前的最基本要求。二、实验原理利用各种物理（如超声波、高温灭菌等）及化学（如强酸浸泡等）上的方法对去除器皿上杂质及其对细胞生长有影响的物质及各种微生物，为试验的无菌操作做最初的准备。并用湿热灭菌法对清洗好的细胞培养专用器皿及用具进行消毒。湿热灭菌法的原理是：湿热法可在较低的温度下达到与干热法相同的灭菌效果，因为：湿热中蛋白吸收水份，更易凝固变性；水分子的穿透力比空气大，更易均匀传递热能；蒸汽有潜热存在，每1克水由气态变成液态可
2、释放出529卡热能，可迅速提高物体的温度。湿热灭菌法一般采用121，灭菌20-30min，如果是产孢子的微生物则应采用灭菌后适宜温度下培养几小时，再灭菌一次，以用于杀死刚刚萌发的孢子。三、细胞培养室的设置及设备1细胞培养实验室的设置a) 无菌操作区：无菌操作室，净化工作台，无菌操作箱b) 孵育区c) 制备区d) 储藏区e) 清洗和消毒灭菌区2细胞培养实验室的设备 仪器：a) 显微镜b) 培养箱c) 冰箱d) 细胞冻存储存器e) 离心机及天平f) 灭菌锅g) 干燥箱h) 水纯化装置 培养用器皿a) 培养器皿：培养瓶，培养皿，多孔培养板b) 培养操作有关的器皿：储液瓶，吸管，加样器 器械 细胞原代
3、培养所需的手术剪刀、器械四、实验步骤1 培养用品的清洗1.1 玻璃器皿的清洗步骤：用毛刷沾取适量洗涤剂刷洗（或用超声清洗仪清洗）用自来水将洗涤剂冲洗干净 于60的恒温箱中烘干 在浓酸（配方见附表）中浸泡过夜 取出浸泡后的器皿，置于盆中，用自来水冲洗至无色 用自来水冲洗，每个器皿用流水灌满，倒掉 蒸馏水冲洗3遍 超纯水（18.2兆欧）冲洗2遍 于60的恒温箱中烘干 1.2 胶塞、盖子等橡胶、塑料制品的清洗用毛刷沾取适量洗涤剂刷洗（或用超声清洗仪清洗） 用自来水将洗涤剂冲洗干净 于60的恒温箱中烘干 在稀盐酸中浸泡30min 蒸馏水漂洗3次 用超纯水（18.2兆欧）漂洗2遍 烘干 1.3 Deco
4、n90清洗法：将Decon90用去离子水稀释至2%到5%的浓度，依据污渍顽固性程度酌情增加溶液浓度，再将待清洗物浸泡2-24小时，加热（40-50摄氏度）使用超声波清洗池清洗30 min，用自来水冲洗干净，然后用超纯水（18.2兆欧）冲洗3遍，在60摄氏度恒温箱中烘干。2 包装a) 将镊子、金属器械、大枪头直接装入铝制饭盒，用胶带将饭盒盖的边缘封住。b) 将装满蓝枪头、黄枪头的枪头盒用报纸包扎好。c) 装PBS的蓝口瓶用锡纸将盖包住，尤以与瓶颈结合处应包好。3 消毒灭菌3.1 湿热消毒使用高压蒸汽灭菌器进行消毒。加热升压之前，打开排气阀门，使加热后消毒器内的残留冷气排出。在106Pa，121条
5、件下消毒20 min。消毒完毕后待至压强降于0 Pa后，打开阀门放气，再打开消毒锅盖。3.2紫外线消毒主要用于实验室房间里的空气、操作台表面及桌椅等消毒。通过紫外线照射将微生物杀死。3.3过滤消毒通过过滤将用于组织细胞培养使用的液体中的杂质及微生物去除，并能防止培养液因高温消毒而变质。3.4净化工作台的消毒用75酒精擦洗台面，紫外灯照射30-50min灭菌，用75酒精擦洗台面，关闭灭菌灯后应启动风机运转2min后再进行培养操作。3.5培养箱的定期维护 由于同学们的操作能力有限，教学实验室的培养箱常年受到污染的困扰。湿式培养基是主要的污染源，应定期移去内容物，包括所有的价值、托盘嗯都需要作彻底清
6、洁，并用无毒的去垢剂，如Decon或Roccall彻底清洗培养箱内部、架子和隔板，然后用70%乙醇清洗去垢剂残迹，待乙醇完全挥发后，再把隔板和培养物放回。可以把杀真菌剂，如2%五、 注意事项a) 因强酸具有强烈的腐蚀性，在捞取时应带上长至上手臂的超厚橡胶手套（每次使用前都要检查是否有漏洞），轻拿轻放，防止溅射。b) 每次用洗涤剂初清洗，烘干后再浸酸，是为了防止器具上的水分将酸稀释，影响清洁效果。c) 可用网兜将同类器皿装在一起再浸泡，兜口系好。系口的绳露于浸泡桶外，方便捞取。d) 超纯水可接在盆里，多次润洗，以节约资源。e) 用过的超纯水接在盆里，可清洗其它培养细胞用的器具。使用后的水可用于高
7、压灭菌锅用水。附表强酸配方 重铬酸钾：63g 浓硫酸 ：1000ml蒸馏水 ：200mlDecon90：一种高级表面活性清洁剂和放射性污染净化剂，可用于实验室、医疗及专门工业的各种用途。Decon90以非黏性浓缩液体形式提供、可用水进行稀释，可生物递减分解、完全可清洗且不易燃烧。公认的高级实验室清洁剂，在实验室清洁应用中成功的代替了铬酸混合清洁剂。迪康90避免了储存、处理、使用和处理腐蚀酸的各种危险，为实验室始终保持可靠的清洁度提供了理想的解决方法。 1. 不包含磷酸盐、酶、乙二铵醋酸/氮川三醋酸（EDTA/TNA）或含氯漂白剂。2. 阴离子与非离子表面活化剂、稳定剂、碱、非磷酸盐洗涤促净剂和
8、分隔剂合成的水基乳剂而产生一种碱性的浓缩物（pH值13+）。3. 用于玻璃制品、陶器制品、塑胶制品（非聚碳酸脂）、橡胶制品、不锈钢制品铁质金属制品的完全清洗和/或污染净化、安全有效4. 作为碱性物质，Decon90不适用于非铁金属制品、特别是铝锌制品，也不适用于聚碳酸脂制品（迪康中性洗涤剂适用于非铁金属制品及聚碳酸脂制品）。使用方法:1. 用去离子水将Decon90稀释调配成浓度为2%至5%溶液。2. 将待清洗物浸泡2至24个小时，浸泡时间依污渍的顽固性及程度而定。3. 清洗严重污染物需增加溶液浓度。4. 加热溶液(40至50摄氏度)或使用超声波清洗池，可以大大缩短清洗时间。5. 清洗物从溶液
9、中取出后，应立即彻底漂洗。清洗物切勿搁置太久再漂洗。用去离子水漂洗三次，以确保完全清除污染物和清洗剂的残留痕迹。6. 烘干。认识一些实验器材及耗材15ml 离心管，进口品牌能保证无菌、无热源、无RNA/DNA酶。国产耗材不能保障使用材质及质量 。推荐品牌Corning，BD Falcon，NUNC等 50 ml离心管，进口品牌能保证无菌、无热源、无RNA/DNA酶。国产耗材不能保障使用材质及质量。推荐品牌Corning，BD Falcon，NUNC等冻存管（2 ml），细胞冻存液的主要储存容器，能耐受-196低温的聚丙烯制成，有硅胶环以保证密封单道及多道移液器，是细胞及分子实验的主要工具。准确
10、定量液体很重要，所以要注意定期校准。同时需要注意每次使用后要将移液器调整至最大量程！推荐品牌：eppendorf，Rainin，Glison，biohit蓝枪头，1ml 黄枪头，200 ul 白枪头，10 ul常见品牌：axygen，eppendorf，rainin细胞培养瓶 多孔培养板，常见为6，12，24，96孔板，无论为几孔培养板均总需12ml细胞悬液（故6孔板每孔为2ml细胞悬液，96孔每孔为125ul细胞悬液）实验二 光学显微镜的原理和应用一 实验目的及要求在科研工作中，显微镜是必不可少的基本工具之一，特别是在细胞生物学、组织病理学等学科中发挥了极其重要的作用。因此有必要熟练掌握各种
11、显微镜的基本原理及操作。本次试验的要求主要有：1 掌握倒置相差显微镜的原理、用途和使用方法。 2 熟悉荧光显微镜的原理、用途和使用方法。二 实验原理1 倒置相差显微镜的工作原理波长、频率、振幅、相位是所有波的四种基本属性。在人的视觉中，可见光波的波长(及频率)的变化，表现为颜色的不同，振幅变化表现为明暗的不同，而相位变化肉眼是感觉不到的。当光通过透明的活细胞时，虽然细胞内部结构厚度不同，但波长和振幅几乎没有改变，只是相位有了差别，所以用普通的光学显微镜无法看清未经染色的活细胞的内部细节。 相差显微镜(phase contrast microscope)利用光的衍射和干涉特性，在普通光学显微镜中
12、增加了二个部件：在聚光镜上加了一个环状光阑，在物镜的后焦面加了一个相板，从而使看不到的相位差变成以明暗表示的振幅差。因此，可以用来观察无色透明活细胞中的细节。倒置显微镜(inverted microscope)的光学原理与普通光学显微镜原理基本相同，它们之间主要差别是倒置显微镜的光源安装在标本的上方，物镜装在标本的下方，因此，可以用来观察生长在培养瓶皿底部的细胞状态。倒置相差显微镜，是相差显微镜和倒置显微镜的结合，即既具有倒置显微镜的倒置观察方式，同时，成像原理则与相差显微镜成像原理相一致。当同一种光通过细胞时，由于细胞不同部分对光的折射率不同，因此，通过细胞的光线和未通过细胞的光线便可以产生
13、相位差。再通过特定的相差板使之发生干涉，如果衍射光线和0-级光线相位相反，则合光的振幅减小，物体图像变暗；如果相位相同，则合光的振幅增大，图像变亮，则可以产生明暗不同的图像。因此，无色透明的样品在显微镜下表现出明暗的对比从而可以被识别。2荧光显微镜的工作原理荧光显微镜(fluorescence microscope)是利用一定波长的光激发标本产生不同颜色的荧光，再通过物镜和目镜的放大作用来显示标本中的某些化学成分和细胞组分的显微装置。某些物质受紫外线照射时可发出荧光，这种物质称荧光物质。细胞内含有少数天然荧光物质，如维生素、脂褐素、核黄素等，经紫外线照射后可自发荧光。还有些细胞成分虽然受照射后
14、不发荧光，但可以与某些荧光物质，如酸性品红、甲基绿、吖啶橙等结合，经紫外线照射后可诱发出荧光。荧光显微镜就是根据这一现象而设计的显微放大装置，可以观察到这些荧光物质在细胞内的分布位置。三 实验器材1实验仪器：倒置相差显微镜，荧光显微镜2实验材料：人肺癌细胞A549（协和细胞中心）、PI (Sigma)、DAPI (Beyotime)四 实验步骤1倒置相差显微镜的使用将培养好的A549细胞从37恒温箱中取出 调节瞳距，使两眼的视野重合 调节屈光度（近视的增加屈光度，老花则减少屈光度） 将培养皿置于载物台上 在低倍镜下调焦至标本最清晰 将需进一步放大观察的目标移至视野中央 换至高倍镜下观察，调节细准焦螺旋至标本最清楚 调节孔径光栅及光源大小，使视野明亮度适中且细胞具有较好的清晰度 观察细胞形态，并判断细胞生长状况2荧光显微镜的使用打开电源开关，当电压表的指针稳定在220 V时再进行下一步操作 启动高压汞灯，等待10 min左右汞灯达稳定状态后，再进行操作 移开光帘(向右拉)，光线进入光路将灯前镜摆出光路 用滤片组的2、3、4中任一组 将染色后的细胞及对照组置于在载物台上，选25物镜，调焦到成像 调节视场光圈及中光源等，使电脑上的图像最清晰 分别观察对照组、经PI、 DAPI染色后细胞的形态五 实验结果1. 倒置相差显微镜观察结
