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1、Chapter2 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法：1. 细胞形态结构的观察方法；2. 细胞组分的分析方法；3. 细胞培养、细胞工程与显微操作技术显微镜的历史：1. SalvinoD Armate 第一个发明眼镜 2. the Jansens 将几个透镜在一个长管中组合，放大倍数增大 3. Anton Van Leeuwenhoek （列文虎克）第一个使用显微镜（270*）4. Robert Hooke 发现细胞，使用原始结构显微镜细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜技术（light microscopy)普通复式光学显微镜（Compound Light Microscope）相差显微镜（
2、phase-contrast microscope）微分干涉显微镜（differential interference contrast microscope，DIC）荧光显微镜（Fluorescence Microscopy）激光共焦扫描显微镜（Laser ConfocalMicroscopy）活细胞工作站（live cell station）（一）普通复式光学显微镜1. 构成（1）照明系统：光源(普通光线可见光)、折光镜、聚光镜、滤光（2）光学放大系统：两组玻璃透镜目镜、物镜（3）机械装置：保证光学系统的准确配置和灵活调控2. 原理：是将两个凸透镜系统适当地组合在仪器上对标本进行放大，经物
3、镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。3. 分辨率：是指区分开两个质点间的最小距离。指分辨物体最小间隔的能力。是显微镜最重要的性能参数。 D=0.61Nsin2 为入射光波长； 数值口径：Nsin2； N=介质折射率； =镜口角（样品对物镜镜口的张角），通常最大值可达140。显微镜的分辨率是由入射光波长和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率。可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可提高分辨率。要增加数值口径，可以提高介质折射率，香柏油的折射率和载片玻璃的折射率（1.52）相近，光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜
4、放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。显微镜的最大有效倍数为1000X。（二）相差显微镜和微分干涉显微镜（发明的人获得物理诺贝尔）利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞的观察A. 当两束光的相位相同时，相互干涉的结果使光波的振幅增加B. 当两束光的相位相反时，则导致光波的振幅降低相差显微镜1、特点：将光程差或相位差转换成振幅差（肉眼可辨）。不需要染色环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相差板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/42、原理：光线透过不同密度的物质时
5、滞留时间长短不同，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。肉眼能够辨认出来。3、用途：可用于观察活细胞，观察未经染色的玻片标本，甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。微分干涉显微镜利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果。适于研究活细胞中较大的细胞器。（三）荧光显微镜Fluorescence Microscope在光镜水平对特异蛋白质等大分子研究的最有力工具之一。1.特点：光源为短波光；有两个特殊的滤光片；需要特异荧光染料。2.原理：以紫外线为光源，经滤色系统发出一定波长的光作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出荧光后，再通过物镜和目镜的
6、放大进行物体的形状及其所在位置的观察。3.结构荧光显微镜与普通光学显微镜相比较，增加了一些附件：荧光光源、激发光滤片和阻断滤片。荧光光源：一般采用超高压汞灯(50-200W)激发滤片（一般有紫色、蓝色和绿色激发片）：使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都过滤掉；阻断滤光片：1）吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛；2）选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。免疫荧光技术两种以上荧光素标记同一样品，可同时显示不同成分在细胞中的定位。 免疫染色为抗原抗体反应。绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合表达。GFP成就诺贝尔奖。荧光显微镜（四）激光共聚焦扫描
7、显微镜（LCSM）LSCM：Laser confocalscanning microscope以激光为光源；聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外的成像；利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上的信息，形成清晰的二维图像；分辨率比普通荧光显微镜高1.41.7 倍（五）活细胞工作站Live cell station计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、DIC、摄影装置于一体；自动化与电子化。二、电子显微镜技术1.电子显微镜的基本知识高分辨率电子束作为光源，波长小于0.1nm电磁透镜聚焦镜筒高度真空图像通过荧
8、光屏或感光胶片记录2.电子显微镜的基本构造电子束照明系统（电子枪和聚光镜）成像系统（物镜、中间镜与投影镜）真空系统记录系统3.电镜分辨本领与有效放大倍数电子显微镜分辨率可达0.2 nm；电镜的分辨本领是指电镜处于最佳状态下的分辨率电镜与光镜光路图比较3.电子显微镜制样技术应用超薄切片技术，几乎可以观察各种细胞的超微结构(2)负染色技术:背景染色，衬托出样品的精细结构观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等用重金属盐(如磷钨酸钠、醋酸铀等)对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的
9、背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差，这样，在图像中背景是黑暗的，而未被包埋的样品颗粒则透明光亮，这种染色称为负染技术。分辨率可达1.5 nm 左右(3)冰冻蚀刻技术包括冰冻断裂和蚀刻复型两步：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露断面结构。向断面喷涂一层蒸汽铂和碳。然后将组织溶掉，把铂和碳的膜剥下来，此膜即为复膜（replica），置于载网上作电镜观察。4.扫描电镜技术（Scanning electron microscope, SEM）观察标本表面结构。分辨率为610nm；电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器
10、收集二次电子成象；为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号；CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题。5.扫描隧道显微镜STM (Scanning tunnel microscope)(发明者诺贝尔)探测微观世界物质表面形貌利用量子力学中的隧道效应具有原子尺度的高分辨本领可以在真空、大气、液体等多种条件下工作非破坏性测量细胞及其组分的分析方法（一） 用超离心技术分离细胞组分 差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开（适用于密度相近，大小不一） 密度梯度离心：通过离
11、心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降带（适用于不同密度）（二）细胞成分的细胞化学显示方法显色剂与所检测细胞组分中特殊基团的结合通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量Eg:福尔根反应Feulgenstain特异显示细胞内呈紫红色的DNA 的分布原理：酸水解可以去除RNA，仅保留DNA，并除去DNA 上嘌呤脱氧核糖核苷键的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露。所暴露的自由醛基与希夫试剂（Schiffs reagent）反应呈紫红色（三）特异蛋白抗原的定位与定性细胞内特异蛋白的显示可通过抗原抗体特异结合的方法得以实现若
12、抗体偶联荧光染料，则可以通过荧光显微镜、激光共焦显微镜观察为了观察特异蛋白在细胞内的精细定位，抗体需偶联电子致密物(胶体金)，用电镜观察（四）细胞内特异核酸的定位与定性原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置光镜水平同位素标记或荧光素标记的探针电镜水平生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合FISH（Fluorescent In Situ Hybridization)荧光原位杂交（五）定量细胞化学分析与细胞分选技术用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术用于细胞周期、细胞凋亡的研究。细胞培养与细胞工程（一）细胞的培养1. 几个基本概念:
13、原代培养（primary culture）：培养来自动物机体的细胞群。将细胞转移到新的容器中培养称为传代或传代培养（passage）。细胞系（cell line）：原代培养细胞成功传代即为细胞系。亚二倍体，接触抑制丧失。克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。2. 动物细胞培养群体培养（mass culture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层；克隆培养（clonalculture）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。Eg：HeLa
14、 宫颈癌上皮细胞 from Henrietta Lacks培养细胞的特性：培养细胞的生长方式：贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长，见于各种实体瘤细胞。悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面，见于各种造血系统肿瘤细胞。1. 细胞克隆形成率实验单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力。克隆形成率克隆形成数接种细胞数2. 台盼蓝法活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力。3. 四唑盐（MTT）比色法四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，四唑盐比色法的原理：活细胞中琥珀酸脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干
15、水的蓝紫色产物Formazan，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。用酶标仪测定OD值可反映活细胞的相对数目。MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。4. 细胞增殖测定：BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)vs.EdU(5-乙炔基-2脱氧尿嘧啶核苷)：胸腺嘧啶核苷类似物BrdU：需要通过BrdU抗体介导的免疫荧光染色EdU：可以和Apollo荧光染料特异性地结合（二）细胞工程1. 细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization）通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。同核体：相同基因型的细胞融合而成。
