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1、-范文最新推荐-1 / 13亚硝酸盐还原酶高产菌选育及发酵研究摘要：亚硝酸盐在自然界中广泛存在，是潜在的致癌物质。因此，亚硝酸盐在食品中过量存在问题已引起世界各国科学界极大关注。植物乳杆菌是一种益生菌，可产亚硝酸盐还原酶，利用生物酶解法降解亚硝酸盐是一种安全有效的新方法。本论文利用实验室保存的植物乳杆菌菌种，研究其生长特性，并利用紫外线诱变、硫酸二乙酯诱变获得的高产菌株通过单因素与正交优化实验来优化发酵培养基配方。主要研究成果如下：通过对紫外诱变突变株的筛选，得到亚硝酸盐还原酶活力较高的突变株 D8，其酶活力为125.0U，比出发菌株的酶活力提高了 22.9%。通过对硫酸二乙酯诱变突变株的筛选
2、，得到亚硝酸盐还原酶活力较高的突变株 DS2，其酶活力为 160.0U，比出发菌株的酶活力提高了 28.0%。通过正交优化的实验结果得到 3 个因素最优参数值分别为葡萄糖 22.0 g/L；牛肉膏 11.0 g/L；硫酸镁 0.5 g/L。最后验证实验得到的酶活力为 228.3U，比优化前高出 13.8%。8820关键词： 植物乳杆菌；亚硝酸盐还原酶；诱变；正交Nitrite reductase high yield breeding and fermentation researchAbstract：Nitrite is a potential carcinogen which can be
3、 widely found in nature. Therefore, the problem of nitrite excessive in food has caused great concern for the scientific community. L.plantarum is the human probiotic that can produce nitrite reductase. Enzymatic degradation of nitrite is a safe and effective new way .In this paper, we used a strain
4、s which saved by the laboratory to study the growth characteristics, and use of UV and diethyl sulfate mutagenesis to obtain high yield strain. Mutation breeding high-yield strains by single-factor orthogonal optimization experiment to optimize the fermentation medium. The study is as follows: by UV
5、 mutagenesis mutant screening, the high nitrite reductase producing mutant D8 was obtained and its nitrite reductase activity was 125.0U, -范文最新推荐-3 / 13which was increased by 22.9% as compared with the staring stain. By diethyl sulfate mutagenesis mutant screening, the high nitrite reductase produci
6、ng mutant DS2 was obtained and its nitrite reductase activity was 160.0U, which was increased by 28.0% as compared with the mutant D8. The response surface optimization of the experimental results of three factors optimal parameter values were glucose 22.0 g / L; beef extract, 11.0 g / L; magnesium
7、sulfate 0.5 g / L. Finally the enzyme activity of the verification experiment was 228.3U, 13.8% higher than before. 2.2.6 亚硝酸盐还原酶提取方法 132.2.7 紫外线诱变 142.2.8 硫酸二乙酯诱变 152.2.9 培养基营养成分单因素实验 162.2.10 营养成分正交优化实验 163 实验结果与分析 173.1 出发菌的生长曲线测定 173.2 亚硝酸盐降解曲线测定 173.3 亚硝酸盐测定标准曲线的绘制 183.4 亚硝酸还原酶的提取结果 193.4.1 考马斯
8、亮蓝法测定蛋白质浓度曲线 193.4.2 硫酸铵梯度盐析盐析结果 193.5 紫外线诱变 203.5.1 紫外线诱变处理菌体致死率实验 203.5.2 紫外线诱变菌株的亚硝酸盐降解量 21-范文最新推荐-5 / 133.5.3 紫外线诱变菌株的酶活力 223.5.4 紫外线诱变菌株遗传稳定性实验 223.6 硫酸二乙酯诱变 233.6.1 硫酸二乙酯诱变菌种菌体致死率曲线 233.6.2 硫酸二乙酯诱变菌株的亚硝酸盐降解量 233.6.3 硫酸二乙酯诱变菌株的酶活力 243.6.4 硫酸二乙酯诱变菌株遗传稳定性实验 243.7 培养基营养成分单因素实验结果分析 253.7.1 碳源的选择 25
9、3.7.2 氮源的选择 26 3.7.3 无机盐的选择 263.8 培养基营养成分正交优化实验结果分析 274 结论 284.1 紫外线诱变植物乳杆菌的工艺研究 284.2 硫酸二乙酯诱变植物乳杆菌的工艺研究 284.3 诱变菌株培养基营养成分单因素实验与正交优化实验 28 1.1.1.2 亚硝酸盐在肉制品中的来源食品在加工过程中的有害物质大多数是外源性的,它们大多是因为加工工艺的需要而在食品中引入的成分。肉制品在加工和贮存过程中，会有一定的亚硝酸-范文最新推荐-7 / 13盐生成。原料肉的红色是由肌红蛋白(Mb)及少量血红蛋白(Hb)所呈现的一种感官性状。新鲜肉中还原型的肌红蛋白呈暗的紫红色
10、，但还原型(亚铁) 肌红蛋白很不稳定，易被氧化。一旦亚铁肌红蛋白中的二价铁被氧化成三价铁，变成高铁血红蛋白，则色泽变暗，继续氧化，里绿色或黄色，影响外观性状。同时，为了使肉制品呈鲜红色，肉制品在加工过程中往往加入发色剂亚硝酸盐或硝酸盐，硝酸盐在细菌作用下，还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐在一定的酸性条件下，形成亚硝酸。一般宰后成熟的肉因糖酵解形成乳酸，pH 值约为 5.65.8。所以此步反应不需外加酸即可进行：生成的亚硝基很快与肌红蛋白或血红蛋白反应，生成鲜艳、亮红的亚硝基肌红蛋白(MbNO)或亚硝基血红蛋 I 白(HbNO)( 少量)。亚硝基肌红蛋白 (或血红蛋白)遇热后，放出疏基(-SH） ，成为
11、具有红色的亚硝基血色源，从而起到固定和增强肉的红色的作用。硝酸盐和亚硝酸盐除作为发色剂5，还能抑制微生物的生长繁殖，起抑菌防腐的作用，特别是对肉毒梭状芽抱杆菌有特殊的抑制作用6。同时，在香肠制作过程中使用亚硝酸盐比不使用亚硝酸盐的香肠在风味上有明显的增强。1.1.2 亚硝酸盐的危害亚硝酸盐对人体的危害主要表现在以下几个方面：(1) 中毒现在的科学研究结果一般认为硝酸盐本身是无毒的。而亚硝酸盐是强氧化剂，进入人体血液后与血红蛋白结合，使氧合血红蛋白变成高铁血红蛋白，导致“高铁血红蛋白症”，使血液失去携带的能力，导致组织缺氧，出现青紫而中毒，并对周围血管有扩张作用，严莺的可
12、能危及生命。 诱变育种主要有以下几方面的作用：（1）提高有效产物的产量；（2）改善菌种特性，提高产品质量；-范文最新推荐-9 / 13（3 ）可以获得各种突变株，其中有些可以改变产物性能，有些能去除多余的代谢产物，有些能改变原有代谢途径，合成新的代谢产物。1.2.1 紫外线—— 物理诱变紫外线是一种使用最早、沿用最久、应用广泛、效果明显的物理诱变剂。它的诱变频率高，而且不易回复突变，是微生物育种中最常用和有效的诱变剂之一。紫外线的诱变机制是紫外线被 DNA 吸收后引起突变的原因，有的使 DNA 与蛋白质的交联，有的使胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用，有的是 DNA 链的断裂
13、，还有的是形成嘧啶二聚体，而形成嘧啶二聚体是产生突变的主要原因。嘧啶二聚体不仅可以由单链上相邻的两个胸腺嘧啶之间反应后形成，也可以产生于双链相对应的两个胸腺嘧啶之间。 微生物在正常生长情况下进行 DNA 复制时，首先DNA 双链解开成为单链，然后两条单链各自与细胞内游离的碱基互补配对形成新链。如果此时双链之间有嘧啶二聚体存在，则因二聚体的交联作用，阻碍双链分开，复制到此处就无法进行下去，造成 DNA 异常状态。如果在一条单链上出现嘧啶二聚体，则会影响复制过程中碱基的正常配对。当DNA 复制到二聚体存在的位置时，可能停止进行，或者超越这一点继续复制，使子代 DNA 形成缺口，碱基错误插入该缺口，
14、造成新链碱基序列与母链不同而引起突变。81.2.2 硫酸二乙酯 ——化学诱变硫酸二乙酯，简称 DES，须保存在棕色瓶中，并在避光、干燥、低温条件下贮存。无色油状液体。有薄荷香。久贮色变深。能与乙醇和乙醚混溶，几乎不溶于水。在冷水中渐渐分解，在热水中迅速分解成乙醇及硫酸一乙酯。 -范文最新推荐-11 / 131.3.1.2 化学降解法(1) 酸性化学环境法在食品中加入硝酸盐，它会与肌红蛋白反应，生成鲜艳的、亮红色的亚硝基肌红蛋白(MbNO)，使食品呈鲜红色，这是因为硝酸盐在细菌作用下，还原成亚硝酸盐，因食品中的乳酸作用，亚硝酸盐再生成亚硝酸，亚硝酸在常温下不稳定，分解出的亚硝基(NO)与肌红蛋白反应，生成亚硝基肌红蛋白。主要反应为：NaNO2+
