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1、猪胚胎体外培养影响因素的研究综述摘要： 本研究以孤雌激活胚胎为研究对象，对猪胚胎体外培养过程中的相关影响因素进行了探讨。体外成熟的猪卵母细胞经孤雌激活后，用添加.05%BSA的 NCSU 一 23 培养的囊胚率(36.7%)极显著高于添加 5%，10%和 15%FCS 的 NCSU一 23(11.8%，18.5%和 10.3%，P0.05)，但囊胚发育率随着 TCM199 比例的增加而显著下降(30.1%vs25.0%，11.1%和 1.1%， P0.05)。将 NCSU23 中的亚牛磺酸浓度从原来的 5mmo 比降低到.25，1.0 或.05mmol 几时，对猪卵母细胞激活后的分裂率和囊胚发
2、育率均无显著影响(介.005)，但完全去掉亚牛磺酸则导致囊胚发育率极显著下降(l.4%)。在猪卵母细胞激活后的 0 币 oh 添加.034mmol几丙酮酸钠和.54mmol 几乳酸钠，显著提高卵母细胞的分裂率(71.0%vs63.9%，P0.05)，但 60h 后在培养液中添加丙酮酸钠和乳酸钠则极显著降低其囊胚发育率(3.0，.63，.33%vs20.2%，P.001)。从胚胎培养开始就添加葡萄糖可提高胚胎的囊胚发育率(20.1%vs10.3%，P0.05)。在 NCSU 一 23 中添加 12mmoUL 的山梨醉，孤雌激活胚胎的囊胚发育率有所提高(32.4%vs26.0%)，但差异不显著(产
3、司.1875)。以上结果表明:(1)BSA 的猪胚胎体外培养效果优于 FCS;(2)猪胚胎的体外培养不需要成分复杂的培养液;(3)亚牛磺酸是猪胚胎培养液必不可少的重要成分，但其浓度可下调到现行的 1/10;(4)乳酸盐和丙酮酸盐对猪胚胎的早期发育有促进作用，但不利于后期发育;葡萄糖对猪胚胎的整个培养发育过程均有促进作用。(5)山梨醇对猪胚胎的体外发育可能具有促进作用，但其效果有待进一步验证。关键词: 猪胚胎；体外培养；分裂率；囊胚率1 前言人们致力于猪胚胎体外生产的研究至少超过了 30 年且在不断的发展与进步中 1- 3。长期以来, 大量的研究试图通过改善培养系统来提高体外胚胎生产效率, 努力
4、提高整个生产系统各个环节的技术水平 2 , 4- 5, 然而进展不大, 目前猪体外成熟 ( I VM ) /体外受精 ( IVF) /体外培养 ( I VC ) 的总体效率仍然较低。卵子的体外成熟和胚胎培养是这一技术的重要环节, 提高这些环节的技术水平对提高整个体外生产体系的效率尤为重要。因此, 本研究拟以猪孤雌激活胚胎为研究对象, 着重探讨猪胚胎体外培养过程的相关影响因素, 以便建立一套有效的猪胚胎体外培养系统。2 材料与方法2 .1 试剂及药品TCM - 199, Gibco 公司生产;犊牛血清 ( FCS) ,Hycl one 公司生产;人绒毛膜促性腺激素 ( hCG) ,宁波激素制品厂
5、生产。除特别注明外 ,其他所有无机盐和生物化学试剂均为 Sigma 公司生产。卵巢保存及运输液 :含有 K+、 Ca2 +、 Mg2 +的生理盐水。洗卵液: TCM - 199 + 2%发情牛血清 (OCS)。成熟液: NCSU - 23 基础液 + 10%卵泡液 ( PPF) +半胱胺酸 +激素。胚胎培养液: NCSU - 23 基础液 +0 . 5%牛血清白蛋白 (BSA)。以上配制的所有试剂均用孔径为 0 . 22m 的微孔滤膜过滤消毒。2 .2 卵母细胞的采集与成熟培养从屠宰场收集青年母猪卵巢 ,将其置于含有 3035 生理盐水的保温瓶内 ,在短时间内送回实验室;然后用 10 mL 注
6、射器和 12 号针头穿刺抽吸卵巢上面 3 8 mm 卵泡内的卵母细胞 ,在体视显微镜下挑选出具有完整卵丘细胞层或部分致密卵丘细胞的卵母细胞 ,用洗卵液清洗 2 次 ,放入已装有 1 . 5 mL 含有激素 (10 U /mL hCG, 0 . 1g/mL FSH)的成熟培养液 (无血清的 NCS U - 23 基础液 + 10% PFF +10 ng/mL EGF + 0 . 1 mg/mL 半胱胺酸 )的玻璃培养皿 (每皿 200300 枚 )中 ,在 38 . 5 、 5% CO2、 饱和湿度的培养箱中体外成熟培养 2022 h,然后转移到不含激素的成熟液中再培养 2224 h。2.3 血
7、清的制备用无菌针头和离心管在发情当天的母牛颈静脉处采血 ,静置 30 min;在 4 冰箱中放置 24 h 左右 ,待血清全部析出后 ,以 3 500 r /min 离心 10 min;吸取血清 ,再以同一转速离心 10 min;弃去沉淀 ,将血清在 56 水浴中灭活 30 min;最后将灭活的血清过滤消毒 ,分装 , - 20 保存 (使用时取出解冻 )。2.4 卵泡液的制备从卵巢表面 38 mm 的卵泡中抽取卵泡液收集于离心管中 , 3 500 r /min 离心 10 min;弃去沉淀 ,直接用 0 . 22m 的滤器过滤灭菌 ,然后小剂量分装 ,于- 20 保存 ,备用。2.5 卵母细
8、胞的激活处理猪卵母细胞成熟培养 4246 h 后,用吸管反复抽打去掉周围的卵丘细胞,然后在含有 5mol /L 离子霉素( i onomycin)的培养液中处理 5 min (38 . 5 ) ,随即用胚胎培养液洗 2 次,移入含有 2 mmol /L 6 -二甲氨基嘌呤(6 - DMAP)的培养液中培养 34 h (38 . 5 )。2.6 卵母细胞体外培养 ( I VC)及早期胚胎发育潜力的评定将经人工激活处理后的卵母细胞置于 50L 的培养液微滴中培养 48 h,检查裂情况 ,中间不换液 ,第 68 天检查囊胚发育情况。2.7 试验设计试验一：蛋白添加物对猪胚胎体外培养的影响本试验旨在比
9、较牛血清白蛋白和不同浓度的胎牛血清的猪胚胎体外培养效果。试验分为 4 组:(l)NCSU 一 23+0.5%BSA;(2)NCSU 一 23+5%FCS;(3)NCSU 一 23+10%FCS;(4)NCSU 一 23 十 15%FCS。经激活处理的猪体外成熟卵母细胞随机分配到各处理组进行胚胎的体外培养。各组结果以 4h8 的分裂率和 6 一 sd 的囊胚发育率来评定。试验二：NCSU 一 23 中添加 TCM 一 199 对猪胚胎体外培养的影响本实验旨在探讨两种不同的培养液按不同比例混合后对培养效果的影响。将 NCSU 一 23 和TCM 一 199 这两种培养液分别各自配制完成后，按照设定
10、的体积比，在平衡前混合均匀，平衡后将猪卵母细胞激活进行培养。试验分为四组，体积比分别为:(1)NCSU 一 23 培养液占 100%，TCM 一 199 培养液占 0%:(2)NCSU 一 23 培养液占 90%，TCM 一 199 培养液占 10%;(3)NCSU 一 23 培养液占 75%，TCM 一 199 培养液占 25%;(4)NCSU 一 23 培养液占 50%，TCM 一 199 培养液占 50%。经激活处理的猪体外成熟卵母细胞随机分配到各处理组进行胚胎的体外培养，实验各组分别按前述的方法进行胚胎发育能力评定。试验三：亚牛磺酸对猪胚胎体外培养效果的影响本试验旨在探讨亚牛磺酸浓度对
11、猪胚胎体外培养效果的影响。根据培养液中亚牛磺酸的浓度实验分为 5 组(O，.05，1.0，.25 和 5.0mnlol 几)。经激活处理的猪体外成熟卵母细胞随机分配到各处理组进行胚胎的体外培养，实验各组分别按前述的方法进行胚胎发育能力评定。试验四：能量底物对猪胚胎体外发育的影响本试验的目的是探讨能量底物对猪胚胎体外发育的影响。试验根据葡萄糖，丙酮酸钠和乳酸钠在胚胎培养中的添加时间(O 一 60h 和 60h 以后)随机分为 7组(见表 2 一 2)。经激活处理的猪体外成熟卵母细胞随机分配到各处理组进行胚胎的体外培养。为了确保一致性，A、B、C、D 四组在 60h 时也换原液一次。各组卵母细胞经
12、成熟后分别按前述的方法进行激活及胚胎发育能力评定。试验五：山梨醇对猪胚胎体外培养的影响本试验旨在探讨山梨醇对猪胚胎体外培养的影响。用改良的 NCSU 一 23 培养液(亚牛磺酸的浓度为.05oIL/)为基础液，然后分别添加不同浓度的山梨醇(O，3，6，12，18olL/)使试验分为 5 组。经激活处理的猪体外成熟卵母细胞随机分配到各处理组进行胚胎的体外培养。实验各组分别按前述的方法进行胚胎发育能力评定。2.8 数据的统计分析所得数据均用卡方检验进行统计分析 ,确定差异的显著性。3 分析与讨论3.1 蛋白质添加物对猪胚胎体外培养的影响己经表明，在培养液中添加蛋白质有利于胚胎的体外发育(carol
13、naetal，1995)。血清和血清白蛋白通常被作为蛋白质来源添加到培养液中用于支持哺乳动物胚胎的体外发育。有人认为，血清中的某些成分能够缓和一些可能对胚胎发育有害因子的作用(Mauer，r1992;Bvaiste，r1995)。血清白蛋白与血清相比，潜在的有害副作用可能更小(Bvaiste，r1995)。血清白蛋白中不但含有各种低亲和力的物质成份，如类固醇、维生素、脂肪酸和胆固醇等，同时包含有各种离子和大分子物质(Maure，1992)。当然，血清中所含有的某些物质同样能够引起胚胎培养条件和环境的恶化和加重某些不利因素的影响(Baviste，r1995)。血清对胚胎体外培养具有双重影响(pi
14、nyopmunrintrandBaviste，r1991:Pinyopint:nadBaviste，r1994;Baviste，r1995)。一方面，干预胚胎卵裂球的分化不利于胚胎的早期发育但能促进细胞的增殖增加囊胚细胞的数量和囊胚的孵化(pinyopmunrintrnadBvaiste，r1991;PinyopununinrtnadBaviste，r1994;Thompsonetal，1992;Rorieetal，1994:Limetal，1994)。利用血清在胚胎后期的作用，可以修改培养液培养方式。他们的做法就是在胚胎期培养时每间隔 48 小时依次从 10、15 到 20%血清浓度递增(B
15、aviste，r1995)。pinyopununinrt 和Bvaister(1994，1996)进一步深化研究，建立了一种二步培养法来进行牛体外受精胚胎的生产，他在受精后 72 小时后才添加血清到培养液中。这种逐步添加血清法和二步培养法已经被一些实验室用于进行牛体外胚胎生产(Zhnagetal，1992;Bvaiste，r1995)。本研究比较 T 胎牛血清浓度(5、10 和巧%)和猪胚胎的体外培养效果，结果发现，在培养液中添加牛血清白蛋白和不同浓度的胎牛血清其培养效果明显不同。在分裂期，含.05%BSA 和 15%FCS 组分裂率较高(87.9%和 87.7%)，比 5%、10%组的分裂率
16、都高(80.8%和 80.0%)。单从分裂看，FCS 的浓度增加可能会提高卵子分裂率，但在后期培养中与 10%FCS 培养液比较囊胚率明显下降。FCS 在三个浓度梯度中，以 10%FCS 添加于培养液中较为合适。但是，与添加 BSA 的培养液比较，效果却不如添加.05%BSA 的培养液。已有报道(PinyPouinirnadBvaist，er1991)表明，血清能够明显抑制体外受精后卵子的分裂，并且在 2 细胞到桑堪胚期没有明显的促进发育的作用。在牛的胚胎体外培养研究中(Whngetal，1997)，在培养液中添加 FCS 比添加 BSA 更能促进囊胚的孵化，但从桑堪胚发育到囊胚时段，添加 BSA 比 FBS 效果更明显。本研究结果也表明，在猪胚胎培养时，在培养液中添加.05%的 BSA 比添加 FCS更能促进胚胎的体外发育。3.2 添加不同比例 TCM 一 199 对猪胚胎体外培养效果的影响长期以来，人们都在致力于如何提高胚胎体外培养效率的研究。培
