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1、氧化铝柱层析精制三七总皂苷工艺研究论文【摘要】目的研究氧化铝柱层析精制三七总皂苷工艺。方法采用HPLC法测定三七总皂苷的含量，考察洗脱剂的浓度、洗脱剂的用量和吸附剂用量对工艺的影响。结果确定最佳精制工艺为：洗脱剂的浓度为55%乙醇，洗脱剂的用量为10倍吸附剂的用量，吸附剂用量为5倍三七总皂苷的用量。结论通过氧化铝柱层析精制后，三七总皂苷的收率大于70%，含量大于80%，说明此精制工艺是可行的。 【关键词】三七总皂苷氧化铝高效液相法 三七为五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根及根茎1，三七总皂苷是中药三七的有效部位，主要含有三七皂苷R1，人参皂苷R
2、g1和人参皂苷Rb1等达玛烷型三萜皂苷类化合物2。现代药理研究证明：三七总皂苷具有多方面的生物活性，主要表现在扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、改善心肌代谢、抗自由基、抗凝、钙拮抗等方面3。 目前三七总皂苷的富集与纯化一般采用大孔吸附树脂来完成4，纯化后三七总皂苷的含量达到60%以上。为了提高药物的安全性和有效性，提高其成药原料药的纯度。本实验拟采用氧化铝柱层析对三七总皂苷的纯化物进行精制5，并对工艺进行了考察，为进一步的制剂学研究打下基础。 1仪器与试药 1.1仪器与设备 RE52-99旋转蒸器（上海亚荣生化仪器厂）；DK-S22型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；JA-1003型电子
3、分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限医疗设备厂）；美国Tsp高效液相色谱仪；TspP-2000泵、TspUV-1000UV-VIS检测器；TspPC1000色谱工作站；色谱柱：ODSC18柱（2504.6mm,5m,大连依利特科学仪器有限公司）。 1.2材料与试剂 三七总皂苷提取物（云南玉溪天然药物有限公司）；三七总皂苷对照品：三七皂苷R1（0745-200008）、人参皂苷Rg1（0703-200015）、人参皂苷Rb1（0704-200115）对照品（中国药品生物制品检定所）；乙腈为色谱纯，水为二次蒸馏水。 2方法与结果 2.1色谱条件 色谱柱：ODS
4、C18柱（2504.6mm,5m）；流动相：A为乙腈，B为水；流速：1.0mLmin-1；采用梯度洗脱法，08分钟（26:74），8:1040:40分钟（34:66）；检测波长203nm；柱温：30；进样量20L。 2.2线性范围关系的考察 分别精密称取三七总皂苷对照品三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1各约6.0mg、2.5mg和2.5mg置25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取此溶液3、4、5、6、7mL置50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述对照品溶液各注入液相色谱仪，记录色谱图，量取峰面积，以峰面积(A)对进样量(g)进行线性回归，三七皂苷R1、人
5、参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1回归方程分别为：A=327127.8W681.2（r=0.9991）；A=406964.1W+787.9（r=0.9991）；A=262563.9W5498.7（r=0.9996），三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂Rb1分别在进样量0.29810.6956g、1.27682.9792g和1.15392.6925g范围内时，峰面积与进样量具有良好的线性关系。 2.3精密度试验 取含量测定项下对照品溶液，连续进样六次，记录色谱图，量取峰面积，计算平均值及相对标准偏差，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的峰面积平均值分别为151792、802039.7和47
6、6940.7，RSD分别为0.81%、1.73%和1.62%，结果表明，本方法精密度良好。 2.4供试品溶液的制备 取上柱流出液浓缩至干，精密称定干粉一定量，用甲醇溶解并转溶至10mL量瓶，滤过。精密量取续滤液1mL置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 2.5工艺参数的考察 2.5.1洗脱剂浓度的考察 取三七总皂苷原料3份，每份10g。分别用50%乙醇适量溶解，分别转移至氧化铝柱（中性氧化铝50g，内径4cm，干法装柱），然后分别用35%、55%和75%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，减压回收乙醇，真空干燥，按HPLC法测定总皂苷含量和收率。 从以上结果可知，当用75%乙醇洗脱时，总皂苷
7、含量最高，但收率太低，而用55%乙醇洗脱时虽然收率比用35%乙醇洗脱时略低，但总皂苷含量高6%左右，因此，洗脱剂确定为55%乙醇。 2.5.2洗脱剂用量考察 取三七总皂苷原料3份，每份10g。分别用50%乙醇适量溶解，分别转移至氧化铝柱（中性氧化铝50g，内径4cm，干法装柱），然后用55%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，减压回收乙醇，真空干燥，按HPLC法测定总苷含量和收率。 从以上结果可知，随着洗脱剂用量的增加，得到总皂苷的含量逐渐下降，考虑收率，以10倍量55%的乙醇洗脱比较合适。 2.5.3吸附剂用量考察 取三七总皂苷原料3份，每份10g。分别用50%乙醇适量溶解，分别转移至氧化铝柱（柱1：
8、中性氧化铝25g，内径2cm；柱2：中性氧化铝50g，内径4cm；柱3：中性氧化铝100g，内径5cm），然后用10倍量55%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，减压回收乙醇，真空干燥，按HPLC法测定总苷含量和收率。 从以上结果可知，随着吸附剂氧化铝用量的增加，收率逐渐降低，而含量呈上升趋势，氧化铝用量为5倍与10倍相比较，前者虽然总皂苷含量略低，但已经大于80%，而且收率较高，因此吸附剂氧化铝的用量确定为5倍。 2.6中试验证结果 取三七总皂苷原料3份，精密称取质量分别为44.4g，42.8g和47.9g，分别用50%乙醇适量溶解，分别转移至氧化铝柱，中性氧化铝用量为三七总皂苷的5倍，然后用10倍量
9、55%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，在60以下减压回收乙醇，真空干燥，按HPLC测定方法，分别测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量。 从以上三批中试结果可知，按选定的精制工艺可以制备总皂苷含量大于80%的三七总皂苷原料，且收率大于70%，说明此精制工艺是可行的。 3结论 3.1氧化铝柱层析精制三七总皂苷的最佳工艺为：洗脱剂的浓度为55%乙醇，洗脱剂的用量为10倍量吸附剂的用量，吸附剂用量为5倍三七总皂苷的用量。 3.2本实验提出了一种新的三七总皂苷的精制方法氧化铝柱层析，具有分离效果好、工艺简单、投资少、处理量较大等优点。有文献报道6，大孔吸附树脂法具有选择性好、吸附容量大、安全
10、无毒、再生容易等优点，但由于应用时间相对较短，还存在着一些问题，因此，在纯化中药有效成分的工艺过程中，两种纯化方法可以互相结合，取长补短，共同促进中药制剂的不断发展。 参考文献 1中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典2005年版二部S.北京：化学工业出版社，2005:9. 2甘烦远.三七的化学成分研究概况J.中国药学杂志，1992，27(3):128. 3ChanP,TomlinsonB.AntioxidantefectsofChinesetraditionalmedicine:focusontrilinoleinisolatedfromtheChineseherbsanchi(Panaxpseudoginseng)J.JClinPharmacol,2000,40(5):457. 4孙建平，崔淑霞，等.大孔吸附树脂富集三七总皂苷的工艺研究J.黑龙江医药，2007，3(20):232-233. 5柳叶.氧化铝柱层析分离纯化磷脂的工艺优化D.浙江大学硕士学位论文.杭州：浙江大学，2006. 6胡军，周跃华，等.大孔吸附树脂在中药成分精制纯化中的应用J.中成药，2002，24(2):127-130.4
