《浙江大学生物化学实验甲 植物材料基因组DNA多态性分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《浙江大学生物化学实验甲 植物材料基因组DNA多态性分析（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、植物材料基因组多态性分析原理一、RAPD 技术的原理RAPD技术是由美国的 Williams等人于 1990年发明的。它是以聚合酶链反应技术(PCR 技术)为基础，利用人工合成的寡核苷酸为引物，以从组织中分离出来的基因组 DNA为模板，通过基因放大器合成多态性 DNA片段的一种方法。由于不同品种 DNA序列存在着差异，其引物结合位点以及两结合位点之间的距离都有差异，这样经 PCR扩增后就产生了 DNA片段的多态性，从而形成了 RAPD标记。RAPD 标记具有以下特点：、标记数量多，因为 RAPD分析所用引物的数量是无限的，所以它可以覆盖基因组中所有的位点。、标记所需模板 DNA量小，因此不受季
2、节、组织、器官及发育时期的限制。、所用引物没有物种限制，一套引物可以用于不同生物基因组分析。、分析方便、快速、无需克隆自卑、同位素标记、Southern 转移等复杂的操作。、标记是显性的，因此不能区别生物个体是纯合型还是杂合型。目前，RAPD 技术已广泛用于基因定位，寻找特定基因的连锁标记，物种识别， 系统进化，遗传多样性检测，遗传作图和遗传育种等众多领域。由于 RAPD技术是以 PCR技术为基础的，因此为了更好的掌握 RAPD技术，有必要先了解 PCR技术。1、PCR 技术的原理多聚酶链式反应技术简称 PCR技术，是近年发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，此法操作简单，可在短时间内获
3、得数百万个特异序列的拷贝，因此 PCR技术虽然问世时间仅数年，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域。在分子克隆、遗传病的基因诊断、法医学、考古学等方面得到了广泛的应用。PCR技术与细胞内发生的复制过程十分类似，为在模板 DNA、引物（16bp 以上，最好为 2024bp）和 4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于 DNA聚合酶的酶促合成反应。按照反应的特点可将其分为三步：、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双连解开形成单链；、退火：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物 DNA量大大多于模板，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板 DNA双链之间互补的机
4、会较少；、延伸：在 DNA聚合酶和 4种脱氧核苷三磷酸底物及 Mg2+存在的条件下，由 DNA聚合酶 5 3的聚合酶活性催化以引物为起点的 DNA链延伸反应。以上 3步为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性 DNA片段将得到大量的复制，数量可达到21067拷贝。（DNA分子数2 2530）循环2530次目的DNA数目达到10 675 33 55 3 3 594变性，双链DNA分子解链成为两条单链5 3 3 5引物1 引物2 55退火，引物与模板DNA 结合72延伸，以引物为起点延伸DNA 链5 33 5 3 5（DNA分子数21）94变性（第2
5、次循环） 5 3 5 3 5 3 5 3 引物1 引物2 55退火5 33 55 3 5 3 5 35 3 3 55 3 72延伸（DNA分子数2 2）如图所示，经过高温变性，低温退火和中温延伸 3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增。每循环一次，目的 DNA的拷贝数加倍，随着循环此数的增加，目的 DNA以 2n的形式堆积。PCR 扩增的特异性是由人工合成的一对寡核苷酸引物所决定的。在反应的最初阶段，原来的 DNA担负着起始模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧地增多而成为主要模板。因此，绝大多数扩增产物将受到所加引物 5末端的限制，最终扩增产物是介于两种引
6、物 5之间的 DNA片段。2、RAPD 的原理RAPD技术通常是利用一系列（通常数百个）不同碱基顺序随机排列的寡聚核苷酸单链（通常为 10bp）为引物，对所研究基因组 DNA进行 PCR扩增。RAPD 所用的一系列引物 DNA序列各不相同，但对于任一一对特定的引物（可相同也可不同） ，如它们同基因组 DNA序列有其特定的结合位点，这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合 PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物 3端相距在一定的长度范围之内（2002000bp） ，就可扩增出 DNA片断。因此如果基因组在这些区域发生 DNA片断插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特
7、定结合位点分布发生相应的变化，而使 PCR产物增加、缺失或发生分子量的改变。通过对扩增产物的检测即可测出基因组 DNA在这些区域的多态性，由于进行 RAPD分析时可用引物数很大，虽然对每一对引物而言其检测基因组 DNA多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组，因此 RAPD可以对整个基因组 DNA进行多态性检测。两个物种的个体之间，亲缘关系越接近，其相应的 PCR扩增带型也就越相似，反之则差异也就越悬殊。二、多态性 DNA随机放大的条件大多在 Williams等（1990）的基础上变动。一般每一个样品的最后混合液为25ul，其中含 25ul 10的 DNA聚合
8、酶缓冲液（由 Tris-HCl，KCl，MgCl 2和明胶等配成） ，各占 100umol/L的 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP，02umol/L 的引物，2025ng的模板 DNA和 05 单位酶量的 DNA聚合酶，然后用蒸馏水将混合物加到 25ul。三、影响 RAPD的因素1、引物引物的合成是随机的，但要满足以下两个条件：G+C 的含量不低于 40%，5 与 3端的碱基顺序非反方向对称，否则就无法合成专一的少数几条 DNA片段。引物的长度以 10bp为佳，引物太短（9bp）易从模板上脱落，聚合反应难以进行，引物太长，成本提高，合成多态性 DNA片段的可能性降低。引物的浓度通常是
9、 02umol/L，这一浓度足以完成 40个循环的扩增反应，引物浓度过高可能导致错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，这两者均可竞争酶、dNTP 和引物。但如引物浓度不足，则 PCR的效率极低，扩增产物的产量太低。2、Taq DNA 聚合酶：酶在 7075时具有最高的活力，此温度下每一个酶蛋白分子每秒可延伸约 150个核苷酸，温度升高（80）或降低（70）时，聚合酶延伸速度明显下降。该酶具有良好的热稳定性，95保温 2小时，活性未见明显损失。该酶具 53聚合酶活性和 53外切酶活力，但无 35的外切酶活力，因此，如 PCR反应中发生某些核苷酸的错配，该酶没有校正功能。该酶为 M
10、g2+依赖性酶，MgCl 2浓度在 20mmol/L 时酶活力最高，Mg 2+浓度偏高，酶活力受抑制。由于 Mg2+能与负离子或负离子团（如磷酸根等）结合，在PCR反应中模板 DNA、引物及 dNTP均可与 Mg2+结合，尤以 dNTP的影响最大，所以 MgCl2浓度在不同反应体系中应适当进行调整，一般反应中 Mg2+浓度至少应比 dNTP总浓度高出 0510mmol/L。KCl的最适浓度是 50mmol/L，高于 75mmol/L时 PCR反应明显抑制，均衡的dNTP有利于酶活性的发挥，并能减少错配和获得多量的特异性 DNA扩增产物。在 25ul反应体系中，聚合酶的用量为 12U，根据扩增片
11、断的长度及复杂程度（G+C 含量）不同而有所区别，使用聚合酶浓度过高，可引起非特异产物的扩增，浓度过低，则合成的产物量减少。3、底物（dNTPs）dNTPs溶液应在-20存放，过多的冻融会使 dNTPs降解。在 RAPD反应中， dNTPs浓度系在饱和浓度(200umol/L)下使用，dNTPs 浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本，反之，低浓度的 dNTPs会导致反应速度的下降，但可提高试验的精确性。4 种 dNTPs在使用时必须以等当量浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率，此外，由于 dNTPs可能与 Mg2+结合，因此，应注意 Mg2+浓度和 dNTPs浓度之
12、间的关系。4、反应的缓冲液缓冲液成分：50 mmol/L KCl 10 mmol/L Tris-HCl （室温下pH=84） 15mmol/L MgCl 2缓冲液中 MgCl2能影响反应的特异性和扩增片断的产率，在一般的 PCR反应中，1520mmol/L 是比较合适的（对应 dNTP浓度为 200umol/L左右） ，Mg 2+过量能增加非特异扩增并影响产率。由于 Mg2+的最佳作用浓度相当低，因此所制备的模板 DNA中不应含有高浓度的鳌合剂，如 EDTA，不应含有高浓度的带负电荷的离子基团，如磷酸根。缓冲液中的 BSA和明胶对酶起保护作用。KCl 在 50mmol/L时能促进引物退火，大于
13、此浓度时将会抑制 TaqDNA聚合酶的活性。1050mmol/L Tris-HCl，pH84，起调节 pH使 TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。5、RAPD 的循环参数PCR扩增是由变性、退火、 （复性）和延伸三个步骤反复循环组成的。其中每一步的温度、时间以及循环次数等参数是非常重要的。、变性一般选择 94，30s1min，可使各种复杂的 DNA分子完全变性。应根据模板 DNA的复杂程度，调整变性温度和时间。对 GC含量高的 DNA，应用较高的变性温度和时间。若变性不充分，会影响 PCR产物的产量，反之若过度变性（温度过高，时间过长）会对 TaqDNA聚合酶活性和 dNTP分子造成损坏。
14、RAPD 反应由于用基因组 DNA，因此变性时间稍长为 1min。、退火由于 RAPD的引物短，因此退火温度应比常规 PCR温度（50）低，为 36，温度过高会引起引物从模板上脱落。退火时间也比常规 PCR(30s)长，为1min30s，以利于引物与模板 DNA的牢固结合。、延伸延伸温度应选择在 7075之间，此时，TaqDNA 聚合酶具最高活力。RAPD反应由于引物过短，延伸温度不利过高，否则不利于引物与模板的结合。RAPD中可采用使反应温度缓慢升高到 7075的方法，因为在最初较低温度下，DNA聚合酶已催化延伸反应开始（15 个 bp/s） ，接下来的较高温度不会对这种延伸过的引物和 DN
15、A模板的结合发生影响。延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般 1分钟延伸足以完成 2kb的序列，扩增片段在 2kb以上，则需加长延伸时间。RAPD 反应由于扩增片段的长度是随机的，有可能有 2kb以上的片段，因此延伸时间比常规 PCR(1min)长，为 1min30s。、循环次数RAPD一般为 3540个，循环次数的选择主要取决于模板 DNA的浓度，浓度高，则循环次数可降低，过高的循环次数（40 次） ，则会增加非特异性产物的量及其复杂度。5、模板RAPD反应由于引物序列短，扩增片段随机，因此为获得理想的结果，除模板中不应含有高浓度的 EDTA和盐离子外，对模板的纯度要求甚高，OD 260/OD280最好在 18，OD 260/OD230 20，工作浓度一般为 50100ng。此外，如模板为环状，则应先将其线状化，因闭环 DNA的扩增效率低。
