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1、【化学生物学创新实验一】人工金属核酸酶-铜邻菲啰啉配合物的合成及其与 DNA 作用摘要：由于金属核酸酶能插入和识别核酸的一些特定结构，可以在光照等条件下使其特定部位断裂或通过电子传递使 DNA 的损伤得以修复，因此，极有希望从人工金属核酸酶中遴选出一些与基因有关的疾病的“诊断试剂”和化学治疗药物。在本实验中通过水合二氯化铜与邻菲罗啉在乙醇溶液中直接配位合成人工金属核酸酶铜邻菲罗啉配合物。对该配合物进行了多种光谱表征。随着 DNA 以定量增加加入，等间隔时对其测定紫外吸收和荧光强度的变化。紫外可见光吸收光谱显示铜邻菲罗啉配合物与 DNA 的作用导致了红移现象，荧光光谱显示其荧光强度增加。两种表征
2、说明了 DNA 与配合物的作用都随 DNA 含量增加而增强。此外，了解了人工金属核酸酶的进展，应用价值及其专一性作用。关键词：人工金属核酸酶，DNA 相互作用Artificial metallonuclease-Copper complex with l,10-Phenanthloline: synthesis and initial DNA interactionAbstract: Due to metallonuclease could insert and identify specific structure of nucleic acids, and make the specifi
3、c area fracture or repair damaged DNA by electron transfer under some conditions, such as illumination.Therefore, it hopes much that we would choose some medicines and diagnostic reagent about gene from artificial metallonuclease.In the experiment, artificial metallonuclease-copper complex with 1,10
4、 phenanthloline was sythetized by copper chloride dihydrate and 1,10 phenanthloline in the solution of ethanol. The compounds were characterized using various spectroscopic techniques. As DNA added with quantitive increase, we measure its change in constant duration. Uv-vis shows the interaction bet
5、ween copper complex with 1,10 phenanthloline and DNA results in red shift, and the fluorescence spectrum shows its intensity becomes higher. We can see that the interaction between DNA and the complex becomes stronger with DNA increasing. Whats more, we konw more about the developement, value of app
6、lication and specific interaction of the compound. Key words: Artificial metallonuclease; DNA interaction一. 实验原理与方法1.1 金属配合物反应的原理与方法【化学生物学创新实验一】金属配合物的反应原理是配体和中心金属形成配位键的过程。金属配合物的合成方法主要有直接配位合成法、取代反应合成法、固相反应合成法、氧化还原反应合成法和大环模板反应合成法等。常采用小型的高压反应釜合成。本实验采用直接配位合成法。直接配位合成法是最简单的合成配合物方法。该合成方法是将金属原子（M）和配体（L）直接相互
7、作用。根据 Lewis 酸碱理论，配合物的直接配位合成反应为：M :L = M:L，主要包括溶剂法和水热溶剂热法。溶剂法是将金属原子和配体分别溶解在合适的溶剂中，然后在常压下直接反应获得配合物的方法。溶剂法合成配合物时，提供中心原子的化合物一般是无机盐（如含氧酸盐，卤化物等） ，氧化物或氢氧化物。对溶剂的要求是反应物在其中能较好的溶解，但碱性要小于目标化合物中配体的碱性，这样才能保证产物在其中不发生分解(水解、醇解等)，同时还要有利于产物分离。水热溶剂热法是将金属盐和配体放入高压反应釜中，利用水或溶剂在高温高压下直接进行配合物生成的反应。水热溶剂热法适应于合成难容或不溶的配合物。1.2 金属核
8、酸酶与核酸作用的研究方法用于研究金属核酸酶与 DNA 作用的研究方法主要有：电子吸收光谱、电子发射光谱、线二色谱 (Linear Dichroism, LD)和圆二色谱(Circular Dichroism, CD)、X-射线衍射和核磁共振谱(NMR) 、电化学方法，也有一些利用流体力学和密度泛函理论计算(density functional theory DFT)等其他方法。1.2.1 电子吸收光谱电子吸收光谱是研究金属配合物与 DNA 相互作用应用广泛、操作简单、有效的方法。金属配合物与 DNA 结合后会导致配体所处的化学环境发生改变，体现在吸收光谱的波长和强度发生变化，这种变化反映了二者
9、相互作用的强弱。一般来说，配合物与 DNA 插入结合时，其吸收光谱通常有减色效应，并伴有一定程度的红移现象。减色效应的程度与配合物和 DNA 作用的强弱成正比，减色效应越大，说明配合物与 DNA 的作用越强。但也有例外，DNA 的加入会使某些配合物的吸收光谱出现增色效应。另外，一些不插入 DNA 的染料如甲基绿、甲基蓝，加入 DNA 时也会引起吸收峰的红移和吸光度的减色。因此，仅凭吸收光谱判断金属配合物与 DNA 的作用模式，有时会得出不正确的结论。1.2.2 电子发射光谱金属配合物以插入方式与 DNA 结合后，由于金属配合物分子的振动模式受到限制，同时减少了金属配合物受水分子或其它阴离子淬灭
10、剂淬灭的机会，其发射光谱一般会增强，但不表示，【化学生物学创新实验一】金属配合物发射光强度越强，其结合 DNA 的能力越强。Tuite E 等发现，与 DNA 紧密结合的发光物会把激发态电子传给 DNA 核苷而导致发光淬灭，减弱发光强度。1.3 人工金属核酸酶与核酸的作用方式金属核酸酶与核酸的作用方式有两种：共价键合（配位结合）与非共价健合。共价结合，如重金属的毒性是重金属离子与核酸间的共价结合作用的，通过干涉基因表达，影响所表达的金属蛋白正常功能调节。非共价键合可分为插入结合、沟槽结合和静电结合，其中插入结合是研究较多的一种作用方式。共价结合是较强的一种结合方式，非共价结合作用相对较弱。1.
11、3.1 配位结合小分子金属配合物与核酸的配位结合方式是由金属离子与碱基上亲核位点间的配位作用形成的。除了软金属离子如 Pt(II)，Pb(II)，Ru(II)等和核酸的碱基的亲和性位置之间可以产生配位结合，还有铂配合物、金配合物和有机锡化合物。最典型的实例就是顺铂 (cisplatin)，卡铂（Carboplatin） ，一类铂族抗癌药。铂类药物在人体内发生抗肿瘤作用时是以病毒的核酸为标靶，即铂类金属配合物与核酸碱基上亲核位点间发生共价配位结合。 随着软度减小，过渡金属离子还能与磷酸根的氧原子配位结合。一般来说，与碱基作用会降低 DNA 双螺旋的稳定性，而与磷酸根的结合则会增加双螺旋稳定性。金
12、属离子与磷酸根的结合优于与碱基结合的顺序为： Mg(II)Co(II)Ni(II)Mn(II)Zn(II)Cd(II)Cu(II)。1.3.2 插入结合非共价插入结合方式是许多小分子与核酸都会发生的结合方式，并非配合物所特有。有机小分子或配位饱和的配合物都能与核酸发生插入作用。一般来说，分子插入 DNA 后，DNA 的稳定性增加，其物理化学性质表现特征是熔点升高，粘度也会增加，这些也是检验分子是否插入DNA 的重要手段。具有插入作用金属配合物可以作为人工核酸酶，应用于 DNA 链上特殊位点的切割，如金属铑配合物Rh-(DPB)2phi 3+对 DNA 片段的碱基位点切割。此外，由于金属配合物具
13、有有机分子所不具备的庞大体积和特殊形状，插入时往往比有机分子有更好的 DNA 序列选择性。特别是八面体多吡啶配合物，由于具有手性中心，还可以作为DNA 探针（probe） ，对 DNA 进行手性识别。1.3.3 沟结合与静电结合【化学生物学创新实验一】金属配合物Co(NH 3)63+能促使 B 型 DNA 向 Z 型 DNA 转化，这个配合物的配体 NH3 上的氢原子能与 DNA 磷酸上的氧原子和鸟嘌呤上的氮原子形成氢键。核酸的外层骨架上的磷酸根基团使其成为一种多聚阴离子，因此大多数金属阳离子与 DNA 之间都存在静电作用，但这种静电结合力非常弱。当然，一个分子与核酸结合时也可能存在多种作用力
14、，比如，Ru(NH 3)4dppz2+是一个阳离子，首先是被静电吸引靠近 DNA，它既可以配体 dppz 插入 DNA 碱基对之间形成 - 堆积，也可以配体 NH3 的氢原子与磷酸根的氧发生氢键作用。1.4 配合物 Cu(phen)2Cl2 与 DNA 结合常数及结合位点1.4.1 荧光光谱法利用 Star-chard 模型和公式：lg(F 0/F-1) = lgK + nlgDNA，式中：Fo 和 F 分别表示配合物不存在和存在时，Cu(phen) 2Cl2-DNA 体系的荧光强度。以 lg(F0/F-1)对 lgDNA作图，由直线的斜率和截距可以计算出 DNA 与配合物作用的结合常数及结合
15、位点数。1.4.2 紫外分光光度法为了定量的研究 Cu(phen)2Cl2 与 DNA 的结合能力的强弱，根据以下方程，测定 Cu(phen)2Cl2与 DNA 的结合常数 Kb1/(A0-A)=1/A+1/(KbA0DNA)式中：A 0 , A 分别为加入 DNA 前后配合物 DNA 混合液的吸光度。以 1/(A0 -A)对 1/DNA作图，则截距与斜率的比值为结合常数 Kb。2结果与讨论：2.1 讨论金属配合物与 DNA 作用的紫外光谱图配合物与DNA相作用后，配合物电子吸收光谱的吸收峰位置红移，强度减小，可认为是配合物与DNA 发生插入作用的证据之一。因为插入配体与DNA碱基对可发生电子
16、堆积，作用配体的*空轨道与碱基的 轨道发生偶合，使能量降低，导致 *跃迁能量减小，从而产生红移现象；同时偶合后的 *轨道因部分填充电子，使 *跃迁几率减小，产生减色效应。图1是此配合物与DNA作用的电子吸收光谱图：【化学生物学创新实验一】图1. 从系列1到系列8依次间隔加入50微升DNA2.2 讨论金属配合物与 DNA 作用的荧光光谱图当金属配合物以插入方式与DNA结合后，随着DNA浓度增大，一般发射光谱会增强。但是，Tuite E 等的研究发现，有些金属配合物与DNA 紧密结合的发光物会把激发态电子传给DNA 而导致发光淬灭，减弱发光强度。因此，不能以金属配合物的发射光强度越强，其结合DNA 的能力越强。（1）金属配合物Cu(phen)2Cl2 与DNA 作用后荧光光谱的变化显示荧光强度增加；其荧光光谱图如下（图2）：配合物具有共轭芳香环的平面结构，能专一平行地嵌入DNA双链的配对碱基之间。在水溶液中，其本身荧光极弱，而DNA分子几乎没有荧光，但当该配合物插入双链DN
