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1、人胚胎生殖细胞向心肌细胞诱导分化及质谱分析的研究王士珍, 朱旻, 冯琦, 陈永珍（苏州大学医学部人体解剖与组织胚胎学系，江苏苏州215123）摘要:目的 分析人胚胎生殖细胞(hEGCs)向心肌细胞分化过程中蛋白质表达谱的改变。方法 组织块培养法体外培养人EG细胞，采用抗坏血酸诱导人EG细胞向心肌细胞分化，通过免疫荧光法检测诱导后细胞中心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达；分别提取人EG细胞及诱导分化2周后细胞蛋白质，采用iTRAQ标记、液相色谱(LC)分离总蛋白，串联质谱(MS/MS)鉴定差异蛋白。结果 诱导后细胞阳性表达cTnT；通过质谱分析和数据库搜索共鉴定出349种蛋白，其中27种蛋白差异显
2、著。结论 人EG细胞能诱导分化为心肌细胞；蛋白质组学方法可高通量筛选人EG细胞向心肌细胞分化相关的重要蛋白。关键词：人胚胎生殖细胞；心肌肌钙蛋白T；质谱Mass Spectrum Analysis of Human Embryonic Germ Cells Induced to Differentiate into CardiomyocytesWANG Shi-zhen, ZHU Min, FENG Qi, CHEN Yong-zhen(Department of Human Anatomy and Histoembryology，Medical School of Soochow Unive
3、rsity，Suzhou 215123，China)Abstract：Objective To analyze the difference of protein profiles between hu- man embryonic germ cells(hEGCs) and cardiomyocytes differentiated from hEGCs. Methods Tissue was cultured in vitro to obtain hEGCs, and then which were induced to differentiate into cardiomyocytes
4、by Ascorbic Acid. The expression of cardiac Troponin T (cTnT) is detected by Immunofluorescence on differentiated cells; Cell total proteins of the hEGCs and hEGCs induced to differentiate for 2 weeks were extracted respectively and labeled by isobaric tags for relative and absolute quantitation (iT
5、RAQ).The labeled proteins were isolated by liquid chromatography 1 / 14基金项目：苏州大学医学发展基金资助项目(EE134710) 收稿日期：2011-03-17作者简介：王士珍(1980-)，男，山东菏泽人，理学硕士，研究方向为人胚胎生殖细胞。通讯作者：陈永珍(LC), and then the different expressing of proteins were identified by Tandem massspectrometry (MS/MS) in hEGCs and differentiated cel
6、ls. Results cTnT was positive expression in differentiated cells;349 proteins were identified by MS analysis and Database search, among which 27 proteins were different expression significantly. Concusions hEGCs are induced to differentiated into cardiomyocytes; Proteomic approach can screen the imp
7、ortant proteins in a high throughput which are related to differentiation of hEGCs induced to cardiomyocytes.Key words: human embryonic germ cells; cTnT; Mass Spectrum 人胚胎生殖细胞（human embryonic germ cells，hEGCs，人EG细胞）是胚胎生殖腺嵴中的原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）经体外培养获得的一种胚胎干细胞。人EG细胞与源于胚泡内细胞群（inner cell
8、 mass, ICM）的ES细胞相似，能在体外未分化状态下无限增殖，并在合适条件下可分化形成多种类型细胞。近年研究表明人EG细胞在不同条件下可向神经细胞1-2、心肌细胞3-4、骨骼肌细胞5等类型细胞分化，其中向心肌细胞的分化尤其引起了人们的极大关注，可以为心肌梗死等心脏危重疾病患者实施细胞治疗提供理想的种子细胞，具有重要的临床应用前景。本研究取5-10周人胚胎生殖腺嵴，组织块培养法体外培养人EG细胞，采用抗坏血酸作为诱导剂，体外诱导人EG细胞向心肌细胞分化，用免疫荧光法观察诱导后细胞cTnT的表达；进而运用iTRAQ-LC-MS/MS技术检测人EG细胞和诱导后细胞差异表达的蛋白，尝试从蛋白质水
9、平分析特征蛋白在干细胞分化过程中所起的重要作用。1 材料和方法1.1 主要试剂DMEM培养液(GIBCO/BRL、高糖)、胎牛血清(Hyclone公司)；白血病抑制因子(LIF；RD公司)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF, RD公司)；抗坏血酸(山东新华制药股份有限公司)；鼠抗人单克隆抗体cTnT(RD公司)、FITC标记的兔抗鼠二抗(武汉博士德)；三氟乙酸(TFA, 上海江莱生物科技有限公司)、iTRAQ试剂盒(ABI公司)、乙腈(ACN、南京亿祥化工有限公司）1.2 胚胎来源收集苏州市立医院本部妇产科人工终止妊娠的5-10周人胚胎共32例，要求流产6小时以内，胚体完整、无严重污染。每例胚
10、胎均征得孕妇和道义委员会的同意。1.3 人胚胎生殖细胞的原代培养组织块培养法体外培养5-10周龄人胚胎生殖腺嵴,以获得人EG细胞，具体方法按文献6 进行操作。1.4 人EG细胞向心肌细胞诱导分化取对数生长期的人EG细胞，将其接种于国产细菌培养皿中(青岛阿尔法公司)进行悬浮培养。每皿含4ml去除LIF的培养基，隔日换液。7天后吸出典型拟胚体置于明胶处理过的24孔培养板中，并加入含0.1mg/ml的抗坏血酸的分化培养基进行贴壁培养。在拟胚体贴壁培养的过程中每天观察拟胚体周围细胞的形态变化。1.5 诱导后心肌细胞的鉴定经抗坏血酸诱导2周后，对细胞爬片做免疫荧光染色，检测诱导后细胞中 cTnT的表达。
11、一抗为鼠抗人cTnT（阴性对照用PBS代替一抗），二抗为FITC标记的兔抗鼠二抗。具体步骤如下：(1)去除培养孔内的培养基，PBS洗2次，加入冷甲醇固定30min (2)用PBS振洗细胞玻片5min，吹干(3)加入稀释的一抗cTnT (1:50)抗体，置湿盒内，4冰箱过夜(4)PBS振洗3次，每次5min，吹干(5)加入1:50稀释的FITC标记的二抗，室温避光孵育1 h(6)PBS洗3次，每次5min(7)用50%缓冲甘油封片，荧光显微镜观察1.6 人EG细胞和诱导后细胞总蛋白的提取分别收集人EG细胞和诱导2周后细胞；用磷酸缓冲液（PBS）清洗细胞3 次；分别转入到1.5ml Eppendo
12、f管中，吸干残留的PBS；加入裂解缓冲液，在室温振荡1h，使其充分溶解；4，40,000g，离心1h；吸取上清并用Brandford 法定量蛋白，然后分装至Eppendof 管里保存在-78 备用。1.7 iTRAQ技术标记蛋白质取人EG细胞蛋白组和诱导细胞蛋白组的蛋白样品各80g，置于洁净的微量离心管中，按iTRAQ标记试剂盒所提供的操作过程对样品进行还原、半胱氨酸封闭、胰酶酶解，然后用iTRAQ试剂对蛋白样品进行差异标记(114标记诱导细胞蛋白组、115标记人EG细胞蛋白组)，将标记好的2组样品混合、除盐、冻干。1.8 液相色谱分离和质谱分析将iTRAQ标记的混合肽重悬于流动相A（10mM
13、 KH2PO4和25ACN，pH 2.7）中，然后通过强阳离子交换色谱(SCX)对标记的混合肽进行初步分离，然后再以流动相B（10mmol/L KH2PO4、350mmol/L KCl和25ACN，pH 2.7）进行线性梯度分离。根据时间收取20个梯度，将这些梯度组分分别冻干并重悬于10l 0.1%TFA中。然后经RP-LC-MS/MS(Q-STAR XL，ABI公司)在线分析。喷雾电压2.1kV，MS扫描范围3001500U；一个质谱图选择4个最强的母离子进行2级质谱扫描，MS/MS扫描范围1001500U。1.9数据分析采用Protein Pilot软件（ABI公司）对通过质谱分析得到的大
14、量数据进行分析，可得到各种肽段精确的定量信息，从而可以推断其相应蛋白的定量信息。通过GO数据库对所鉴定的差异表达的蛋白进行功能分类。2 结果2.1人EG细胞原代培养组织块贴壁培养24小时，少量单个人EG细胞游离出组织块，细胞呈圆形或椭圆形，核大胞质少，折光性强；培养第3天，人EG细胞及胚胎成纤维细胞数量均增多，胚胎成纤维细胞成梭形，贴壁生长(图1-1)；培养第5天，人EG细胞开始聚集，明显成团生长；培养第7天，在胚胎成纤维细胞层上出现EG细胞集落，集落内人EG细胞排列紧密，界限不清，形成典型的“鸟巢”状结构，约有200300个细胞（图1-2）。2.2 拟胚体的形成与贴壁培养悬浮培养7天后，肉眼
15、可见人EG细胞形成的拟胚体（EBs），在一个6cm的国产细菌培养皿中平均可形成150-200个大小不一的EBs（图1-3）。贴壁培养的拟胚体24 h后已贴壁并开始分化，1周后拟胚体周边分化出梭形、多边形细胞、细胞形态变得不规则，且分化的细胞不断地增殖(图1-4)。2.3免疫荧光法鉴定分化的心肌细胞经0.1mg/ml抗坏血酸诱导2周，免疫荧光法检测显示，有些诱导后细胞阳性表达 cTnT。绿色荧光在阳性细胞胞浆中均匀分布，细胞呈多边形、不规则形(图1-5)。对照组cTnT呈阴性表达（图1-6）。心肌肌钙蛋白T(cTnT)为心肌细胞特异性标记物，它在诱导后细胞中呈阳性表达，说明人EG细胞已向心肌细胞
16、分化。2.4 质谱分析结果从质谱分析结果来看，共鉴定出349种蛋白(蛋白置信度95%)。其中27种蛋白(21种上调蛋白、6种下调蛋白)在人EG细胞和诱导后细胞中差异显著（差异倍数3）。这些差异蛋白按功能包括细胞骨架蛋白:肌动蛋白、肌钙蛋白C、核纤层蛋白-A/C、微管蛋白链等；代谢酶：NADH脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、糖原磷酸化酶等；应激蛋白：70KD 热休克蛋白；蛋白翻译相关蛋白：延伸因子Tu、60S核糖体蛋白等；抗氧化蛋白：peroxiredoxin-4；以及其它功能蛋白（表1、2）。3 讨论人EG细胞同来源于内细胞群的胚胎干细胞一样在体外可以无限增殖、自我更新、并在合适条件下分化为各种类型细胞。Takahashi等7研究表明,抗坏血酸能促进ES细胞向心肌细胞分化。国内的华进联等
